转染植物和减少随机整合事件的方法技术

本公开提供了用于转染植物的方法和用于在植物中表达RNA或多肽分子的方法。特别地，转染具有降低的POLQ表达和/或活性的植物以减少随机整合事件。本公开还提供了通过本文公开的方法产生的转染植物和植物后代。

Transfecting plants and reducing random integration events

The present disclosure provides methods for transfecting plants and for expressing RNA or polypeptide molecules in plants. In particular, plants with reduced POLQ expression and/or activity were transfected to reduce random integration events. The present disclosure also provides transfected plants and plant offspring generated by the methods disclosed herein.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】转染植物和减少随机整合事件的方法专利
本公开提供了用于转染植物的方法和在植物中表达RNA或多肽分子的方法。特别地，转染具有降低的POLQ表达和/或活性的植物以减少随机整合事件。本公开还提供了通过本文公开的方法产生的转染植物和植物后代。专利技术背景通过转染对植物进行基因改造允许改变性状，例如增加产量，抗病虫害，增加营养生物量，除草剂耐受性，营养质量，干旱和胁迫耐受性，以及园艺品质如色素形成和生长，以及作物改良的其他农艺特性。此外，基因修饰的植物已被用作表达重组蛋白的系统。用核酸转染植物如今是一种常见的做法，其可以通过本领域已知的许多不同方法来进行。然而，现有转染方法的一个缺点是在宿主基因组中产生相对大量的随机DNA整合事件。随机整合可对宿主生物体产生不可预测和/或有害的影响。此外，将DNA整合到植物基因组中并不总是可取的，特别是当基因改造(GMO)的植物引起环境和政治问题时。因此，仍然需要开发用于植物中表达转基因的改良系统。专利技术简述本公开一方面提供了用于减少转染的核酸分子在植物细胞中随机整合的方法，所述方法包括向植物细胞提供核酸分子，其中所述植物细胞中的POLQ表达和/或活性降低。本公开另一方面提供了用核酸分子转染植物细胞的方法，所述方法包括向植物细胞提供核酸分子，其中所述植物细胞中的POLQ表达和/或活性降低。在优选的实施方案中，所述方法用于基因打靶。具体地，所述方法用于通过基因重组产生在其基因组中的特定位点携带DNA序列的植物细胞。本公开另一方面提供了用于在植物细胞中表达RNA分子或多肽的方法，所述方法包括向植物细胞提供编码所述RNA分子或多肽的核酸分子，其中所述宿主细胞中的POLQ表达和/或活性降低。本公开另一方面提供了用于产生表达RNA分子或多肽的植物的方法，所述方法包括向植物细胞提供编码所述RNA分子或多肽的核酸分子，以及由所述植物细胞产生植物，其中所述植物细胞中的POLQ表达和/或活性降低。优选地，将核酸分子转染到具有降低的PolQ表达和/或活性的植物细胞中。在一些实施方案中，将核酸分子瞬时转染到植物细胞中。优选地，核酸包含植物表达盒。优选地，植物表达盒包含编码多肽或RNA分子的核酸序列和驱动表达的调控序列。优选地，核酸是核酸酶。优选地，核酸是Crispr/Cas系统组分。在一些实施方案中，核酸分子通过基因重组在特定位点整合到植物细胞的染色体(或者更确切地说，通过位点特异性基因重组或同源重组)。优选地，这种稳定整合导致异源多肽或RNA分子的表达。在一些实施方案中，整合是同源重组的结果。在一些实施方案中，这种稳定整合破坏或修饰内源基因。在一些实施方案中，整合是位点特异性重组的结果。在一些实施方案中，所述植物细胞包含对由POLQ基因编码的前mRNA具有特异性的反义寡核苷酸，或对由POLQ基因编码的mRNA具有特异性的双链RNAi分子。在一些实施方案中，植物细胞具有突变的POLQ基因。在一些实施方案中，植物细胞具有POLQ基因的敲除。本公开另一方面提供了通过本文公开的方法产生的植物及其后代(包括种子)。优选地，所述植物和后代包含通过基因重组(即，位点特异性整合和非随机整合)稳定整合到基因组的核酸分子。在上述的一些实施方案中，所述植物细胞不是拟南芥的。本公开另一方面提供了植物或植物细胞，其中所述植物或植物细胞中的POLQ表达和/或活性降低，并且其中所述植物或植物细胞不是拟南芥的。本公开还提供了所述植物和细胞用于转染核酸分子的用途。本公开另一方面提供了具有降低的POLQ表达和/或活性的植物或植物细胞用于产生表达RNA分子或多肽的植物的用途，其中a)编码所述RNA分子或多肽的核酸分子未整合到植物细胞染色体，或者b)编码所述RNA分子或多肽的核酸分子通过位点特异性基因重组或同源重组整合到植物细胞的染色体。附图简述图1：Polθ缺陷型植物通过浸花法转化对T-DNA整合是难以控制的。a，浸花法转化策略：(1)将开花的拟南芥植物浸入含有农杆菌细胞的悬浮液中，然后(2)使植物产生种子。(3)将小百分比可能已经转基因(描绘为黄色)的种子播种于(4)含有适当除草剂作为选择标志物的固化培养基。b，含有除草剂膦丝菌素(PPT)的平板(其上播种了浸花法转化后收集的野生型(左)和teb-5(右)种子)的代表性图像。已稳定整合的含有选择标志物的T-DNA的转化苗是PPT抗性的。c，使用以下两种不同的卸甲农杆菌菌株进行浸花法实验：补充有二元载体pCAMBIA1301的LBA1100和补充有二元载体pSDM3900的AGL1。d，在发育的长角果中瞬时表达ACT11启动子(蓝色)控制下的含有内含子的GUS报告基因(gusA)的发育胚胎的代表性图像。图2：Polθ是根转化介导的拟南芥转基因所必需的。a，根转化策略。使种子在液体培养物中萌发(1)，并收集10天龄的拟南芥苗的根，在固化培养基上预培养2-3天，并与农杆菌细胞共培养(2)。在含有除草剂PPT的固化培养基上形成愈伤组织/芽，并且在三周后将其转移到新鲜平板上，其上的芽已稳定整合T-DNA而获得抗性标志物，可以继续生长(3)。b，含有除草剂膦丝菌素(PPT)的平板(其上生长野生型(左)和teb-5(右)根以允许芽形成)的代表性图像。野生型芽(左图)已获得PPT抗性，指向稳定的T-DNA整合，而teb-5芽(右图)正在恶化。c，用于回收T-DNA-植物基因组连接的TAIL-PCR产生大多数野生型愈伤组织的产物(上图)，而teb-5愈伤组织在TAIL-PCR中未产生任何产物(下图)。d，野生型根外植体，其中箭头指向GUS阳性斑点，其中农杆菌已递送一个或多个含有含内含子的GUS报告基因的T-DNA。e，计数野生型Col-0，teb-2和teb-5每个外植体的GUS阳性斑点。每次实验计数至少100个根外植体。f，计数野生型Col-0，teb-2和teb-5绿芽的形成，表明T-DNA的稳定整合。图3：填充物DNA反映了最小配对的T-DNA-拟南芥基因组分子的Polθ依赖性延伸。a，所提出的Polθ在T-DNA整合中的作用：通过Polθ的DNA合成使最小配对的3'突出DNA末端稳定，一端由T-DNA提供，另一端由拟南芥基因组提供。T-DNA-基因组连接点是以下两种类型中的一种：约57％的测序连接点含有填充物DNA，而约43％的测序等位基因不含填充物。b，最长公共子串(LCS)分析的示意图。对于每种填充物(蓝色)，确定填充物和靶序列之间最长可能的序列同一性区段。c，具有6至40nt大小填充物的T-DNA的LCS的热图代表。在左图中，绘制了伪随机概率(对于方法，参见方法部分)，而中间图反映了完整的数据集，其中搜索空间包含T-DNA插入物两侧的基因组拟南芥序列(相对于连接点-120bp至+160bp)，插入物内(从连接点开始)160bp的T-DNA序列和120bp的T-DNA原始侧翼，即质粒DNA。右图显示数据超概率差异，从而可视化过度呈现(黄色到红色)和呈现不足(浅蓝色到深蓝色)。根据该差异热图，T-DNA整合的百分比被确定为48.2％，其中它们的同源填充物相对于概率过度呈现超过10倍。d，在c中确定的子类别(n＝1,653)用于绘制相对于整合位点的位置(5bpbin大小)。e，含有本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.在植物细胞中减少转染的核酸分子的随机整合的方法，所述方法包括用核酸分子转染植物细胞，其中与野生型植物细胞相比，所述植物细胞中的POLQ表达和/或活性降低。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.03.24 EP 16162322.81.在植物细胞中减少转染的核酸分子的随机整合的方法，所述方法包括用核酸分子转染植物细胞，其中与野生型植物细胞相比，所述植物细胞中的POLQ表达和/或活性降低。2.用核酸分子转染植物细胞的方法，所述方法包括用核酸分子转染植物细胞，其中与野生型植物细胞相比，所述植物细胞中的POLQ表达和/或活性降低。3.在植物细胞中表达RNA分子或多肽的方法，所述方法包括用编码所述RNA分子或多肽的核酸分子转染植物细胞，其中与野生型植物细胞相比，所述植物细胞中的POLQ表达和/或活性降低。4.产生表达RNA分子或多肽的植物的方法，所述方法包括用编码所述RNA分子或多肽的核酸分子转染植物细胞并由所述植物细胞产生所述植物，其中与野生型植物细胞相比，所述植物细胞中的POLQ表达和/或活性降低。5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中将所述核酸分子瞬时转染到植物细胞中。6.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述核酸分子通过位点特异性基因重组或同源重组整合至植物细胞的染色体中。7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述植物细胞包含对由POLQ基因编码的前mRNA具有特异性的反义寡核苷酸，或对由POLQ基因编码的mRNA具有特异性的双链RNAi分子。...

【专利技术属性】
技术研发人员：马塞尔·蒂斯特曼，玛尔杰·范克雷滕，保罗·霍亚卡斯，
申请(专利权)人：莱顿大学，莱顿教学医院，
类型：发明
国别省市：荷兰,NL