单链环状核酸及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种单链环状核酸及其制备方法和应用，涉及分子生物学技术领域，本发明专利技术提供的环状核酸的制备方法，包括具有末端发夹结构的线性核酸在与成环辅助链杂交后，经连接酶连接使两端闭合，得到单链环状核酸。该方法显著降低了副产物的生成。运用这种“末端发夹”连接方法，使线性核酸在连接酶连接下，在常规体系中的单环成环率可达近100％。并且，大多数的核酸单链在连接体系中均会形成发夹结构，所以本发明专利技术提供的制备方法的通用性极高。此外，该方法操作简单，耗时较短，无需专门的实验人员即可进行操作，在节约人力及时间成本的基础上，还具有普适性广的优点。

Single-chain cyclic nucleic acid and its preparation method and Application

The invention provides a single-stranded cyclic nucleic acid and its preparation method and application, which relates to the technical field of molecular biology. The preparation method of the cyclic nucleic acid provided by the invention includes a linear nucleic acid with terminal hairpin structure and a single-stranded cyclic nucleic acid after hybridizing with a ring-forming auxiliary chain and closing the ends by ligase connection. This method significantly reduces the production of by-products. By using this \end hairpin\ method, the cyclization rate of linear nucleic acids in the conventional system can reach nearly 100% under the ligase ligation. Moreover, most single strands of nucleic acid form hairpin structure in the connecting system, so the preparation method provided by the invention has high universality. In addition, the method is simple, time-consuming and can be operated without special experimenters. On the basis of saving manpower and time cost, it also has the advantages of wide applicability.

【技术实现步骤摘要】
单链环状核酸及其制备方法和应用
本专利技术涉及分子生物学
，尤其是涉及一种单链环状核酸及其制备方法和应用。
技术介绍
核酸不仅仅是遗传信息的载体，也是一种构建纳米结构的材料，特别是近些年来，核酸机器的设计成为了研究热点，不同的核酸机器可呈现“网笼”、“链锁”等形状，其有可能用于药物载体、物质运输、液体计算等方面。单链环状核酸是一种由单链DNA、RNA或其他修饰核酸链首尾相接形成的环状将结构，由于其独特的动力学和拓扑学性质使其在构建纳米材料时起到了重要作用。此外，环状核酸除了可以用于构建纳米材料外，也可用于滚环扩增、食品溯源及核酸拓扑结构的研究等。所以，单链线性核酸能否环化成功或者线性核酸环化后能够得到单一的环状核酸产物成为当前研究的焦点。当前，大多数单链环状核酸的合成，是在连接酶、成环辅助链(与单链DNA或RNA的3’和5’末端互补的短链)的作用下，首尾相连成为闭合的环(如图1途径①)。然而，单链环状核酸制备过程中面临的主要问题是难以抑制高底物浓度下分子间连接产生的副产物。比如说在反应体系中，多条模板单链在成环辅助链作用下相互连接(如图1途径②)，形成多聚物，即在连接底物的浓度较高的情况下，体系内分子间距离拉近，使分子间的碰撞几率增大，而线性核酸两端分子内的碰撞几率不变，分子间与分子内的碰撞几率差别变小，最终导致分子间连接效率的增高，多聚物产量急剧增加。最近，对于高浓度连接会产生大量副产物的问题，已有实验证明在低buffer浓度的条件下能够有效减少连环过程中的副产物，其低buffer就是降低了反应效率，使分子间的连接效率大幅下降，使分子内的连接处于优势，但是其存在操作繁琐，耗时较长等缺点。因此，开发一种能够有效使线性核酸连接为环状核酸，且连接效率高、副产物少，操作简单、耗时短的环状核酸的制备方法尤为重要。有鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的在于提供一种单链环状核酸的制备方法，以缓解现有技术中存在的单链环状核酸连接效率低、副产物较多或操作繁琐，耗时较长的技术问题。本专利技术的第二个目的在于由上述方法制备得到的单链环状核酸。本专利技术的第三个目的在于提供上述单链环状核酸在构建纳米材料、滚环扩增、食品溯源或核酸拓扑结构研究中的一种或多种中的应用。本专利技术提供了一种单链环状核酸的制备方法，所述制备方法包括：经连接酶连接，使与成环辅助链杂交后的线性核酸两端闭合，得到所述环状核酸；其中，所述线性核酸具有发夹结构，所述发夹结构位于所述线性核酸与所述成环辅助链的连接处；所述成环辅助链与所述线性核酸的3’端和5’端互补。进一步地，将所述线性核酸进行二级结构模拟，选择稳定的发夹结构作为所述线性核酸与所述成环辅助链的连接处。进一步地，所述线性核酸的长度为40-200nt，优选为44-200nt，更优选为54-200nt。进一步地，所述发夹结构的Tm值高于连接反应温度10-60℃，优选为高于连接反应温度20-40℃。进一步地，将所述线性核酸、成环辅助链、连接酶和连接缓冲液混合为同一连接体系，进行连接反应；优选地，所述连接反应的时间为1-5小时；优选地，所述连接反应的缓冲液为标准缓冲液的0.1-1倍。进一步地，所述连接酶为可连接双链DNA、双链RNA或DNA-RNA杂交链中的切刻部分的连接酶；优选地，所述连接酶为T4DNA连接酶、T4RNA连接酶、T3DNA接酶、T7DNA连接酶或E.coliDNA连接酶中的任意一种。进一步地，所述线性核酸的浓度为1-100μM，优选为5-50μM。进一步地，所述线性核酸与所述成环辅助链的摩尔比为1:1-5，优选为1:1-3。本专利技术还提供了应用上述的制备方法制备得到的环状核酸。另外，本专利技术还提供了上述的环状核酸在构建纳米材料、滚环扩增、食品溯源或核酸拓扑结构研究中的一种或多种中的应用。本专利技术提供的环状核酸的制备方法，包括经连接酶连接，使与成环辅助链杂交后的具有发夹结构的线性核酸两端闭合，得到环状核酸。将线性核酸与成环辅助链的连接处设计为发夹结构，能够保证在连接体系中，先会有少部分发夹结构打开与成环辅助链连接进行成环，使连接体系中可以连接的分子始终保持在浓度较低的水平，这样使分子内相互连接的优势处于较为明显的地位，大大降低了副产物的生成。运用这种“末端发夹”连接方法，使线性核酸在连接酶连接下，在常规体系中的单环成环率可达近100％。并且，大多数的核酸单链在连接体系中均会形成发夹结构，所以本专利技术提供的制备方法的通用性极高。此外，该方法操作简单，耗时较短，无需专门的实验人员即可进行操作，在节约人力及时间成本的基础上，还具有普适性广的优点。附图说明为了更清楚地说明本专利技术具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本专利技术的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为本专利技术提供的有发夹末端的线性核酸连接成环示意图；图2A为本专利技术实施例1提供的L643-4,24-4的Mfold模拟图；图2B为本专利技术实施例1提供的L6416-4,37-4的Mfold模拟图；图2C为本专利技术实施例1提供的发夹位置对连接的成环目的产物量的影响结果比较结果图；图3A为本专利技术实施例2提供的L743-4,24-4,65-2的线性核酸的Mfold模拟图；图3B为本专利技术实施例2提供的L643-4,24-4,55-2的线性核酸的Mfold模拟图；图3C为本专利技术实施例2提供的L543-4,24-4,45-2的线性核酸的Mfold模拟图；图3D为本专利技术实施例2提供的L4414-6,24-4,55-2的线性核酸的Mfold模拟图；图3E为本专利技术实施例2提供的L3414-6,35-2的线性核酸的Mfold模拟图；图3F为本专利技术实施例2提供的不同长度的具有末端发夹结构的单链的连接比较的结果图；图4A为本专利技术实施例3提供的L642-4,23-4,51-2的线性核酸的Mfold模拟图；图4B为本专利技术实施例3提供的L643-4,24-4的线性核酸的Mfold模拟图；图4C为本专利技术实施例3提供的L644-4,25-4的线性核酸的Mfold模拟图；图4D为本专利技术实施例3提供的L645-4,26-4的线性核酸的Mfold模拟图；图4E为本专利技术实施例3提供的L646-4,27-4的线性核酸的Mfold模拟图；图4F为本专利技术实施例3提供的不同连接位置比较结果图；图5A为本专利技术实施例4提供的L640-4,24-4的线性核酸的Mfold模拟图；图5B为本专利技术实施例4提供的L640-6,24-4的线性核酸的Mfold模拟图；图5C为本专利技术实施例4提供的L640-7,24-4的线性核酸的Mfold模拟图；图5D为本专利技术实施例4提供的L640-7,20-4的线性核酸的Mfold模拟图；图5E为本专利技术实施例4提供的不同稳定性的发夹在链的末端的连接成环比较结果图；图6A为本专利技术实施例5提供的L643-4,24-4的连接转化率及环状核酸产率的统计图；图6B为本专利技术实施例5提供的L6416-4,37-4的连接转化率及环状核酸产率的统计图；图7A为本专利技术实施例6提供的L643-4,24-4的高浓度成环电泳图；图7本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种单链环状核酸的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：经连接酶连接，使与成环辅助链杂交后的线性核酸两端闭合，得到所述单链环状核酸；其中，所述线性核酸具有发夹结构，所述发夹结构位于所述线性核酸与所述成环辅助链的杂交处；所述成环辅助链与所述线性核酸的3’端和5’端互补。

【技术特征摘要】
1.一种单链环状核酸的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：经连接酶连接，使与成环辅助链杂交后的线性核酸两端闭合，得到所述单链环状核酸；其中，所述线性核酸具有发夹结构，所述发夹结构位于所述线性核酸与所述成环辅助链的杂交处；所述成环辅助链与所述线性核酸的3’端和5’端互补。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，将所述线性核酸进行二级结构模拟，选择稳定的发夹结构作为所述线性核酸的杂交处。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述线性核酸的长度为40-200nt，优选为44-200nt，更优选为54-200nt。4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述发夹结构的Tm值高于连接反应温度10-60℃，优选为高于连接反应温度20-40℃。5.根据权利要求1-4任一项所述的制备方法，其特征在于，将所述线性核酸、成环辅助链、连接酶和连接缓冲液混合为同一...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁兴国，安然，崔一笑，
申请(专利权)人：中国海洋大学，
类型：发明
国别省市：山东,37