一种用柱花草表达的基因重组人血清白蛋白及表达方法技术

一种用柱花草表达的基因重组人血清白蛋白及表达方法，涉及一种转入了人血清白蛋白基因的柱花草的制备方法，以及从该转基因柱花草中表达的人血清白蛋白。目的是以基因重组人血清白蛋白在柱花草中的表达作为从人血清中提取分离血清白蛋白的替代方法，解决其来源有限且价格昂贵的问题。方法：一、以柱花草无菌苗真叶为外植体诱导形成愈伤组织；二、农杆菌菌液的活化与重悬；三、用农杆菌重悬液对胚性脆性愈伤组织进行转染；四、将转染后的愈伤组织转入共培养基上共培养；五、将愈伤组织移入筛选分化培养基中筛选培养，诱导抗性植物再生，鉴定为阳性的即为转基因柱花草。本发明专利技术用于获得可表达基因重组人血清白蛋白的转基因柱花草以及从中表达人血清白蛋白。

A Recombinant Human Serum Albumin Gene Expressed by Stylosanthes and Its Expression Method

A recombinant human serum albumin expressed by Stylosanthes and its expression method involve a preparation method of Stylosanthes transformed into human serum albumin gene and human serum albumin expressed from the transgenic Stylosanthes. The aim is to use the expression of recombinant human serum albumin in Stylosanthes as an alternative method to extract and isolate serum albumin from human serum, so as to solve the problem of limited source and high price. Methods: First, callus was induced from the true leaves of Stylosanthes stigmata seedlings as explants; secondly, activation and suspension of Agrobacterium solution; thirdly, embryonic fragile callus was transfected with Agrobacterium heavy suspension; fourthly, the transfected callus was co-cultured on co-culture medium; fifthly, callus was transferred into screening differentiation medium to induce regeneration of resistant plants. Genetically modified Stylosanthes were identified as positive. The invention is used to obtain genetically modified Stylo grass expressing recombinant human serum albumin and to express human serum albumin therefrom.

【技术实现步骤摘要】
一种用柱花草表达的基因重组人血清白蛋白及表达方法技术邻域本专利技术涉及转基因柱花草的制备，并用该转基因柱花草表达人血清白蛋白。技术背景人血清白蛋白(Humanserumalbumin，HSA)是人血浆中主要的蛋白质，约占血浆总蛋白的60％，由585个氨基酸组成的单链无糖基化的蛋白质，分子质量为66.5kD，等电点在4.7～4.9之间。HSA的主要生理功能在于维持血液胶体渗透压；结合并运输内源性及外源性物质，其中包括脂肪酸、胆色素、激素、生物学活性物质及药物等；临床上用于烧伤和严重失血等引起的休克、急性缺血性脑卒中、肾病综合症、肝硬化、肺性脑病、糖尿病性肾病和皮肤溃烂，也可作为血浆增容剂。血浆白蛋白每下降2.5g/L，死亡危险性增加24％～56％；当血浆白蛋白水平<20g/L，患者死亡率几乎是100％。在制药领域，HSA广泛用作保护剂、稳定剂和赋形剂等。目前，HSA全球年市场需求量超过600吨。临床使用的HSA主要通过人体血液提取，受人血来源不足和血源传染病的影响，供应相对紧张。因此，重组人血清白蛋白的生产作为一种获得大量无病原HSA的替代方法越来越受到重视。由于临床上HSA的使用剂量为每日5～10g，现有微生物表达系统的生产规模无法满足需要，转基因动物制备的基因重组HSA传播疾病的潜在风险。到目前为止，利用酵母和转基因水稻等制备的基因重组HSA主要用做培养基或者制剂辅料，仍然不能满足临床用药需求。
技术实现思路
本专利技术是针对现有原核或真核生物为生物反应器的表达量低、无生物活性或不安全等特点，为解决目前人血白蛋白来源有限及价格昂贵的问题，提供一种表达基因重组人血白蛋白的转基因柱花草的制备方法，并从中表达人血清白蛋白。本专利技术用柱花草表达的基因重组人血清白蛋白及表达方法，按以下步骤进行：一、选择籽粒饱满的柱花草种子去除褐色种皮后进行消毒处理，将去皮的种子于80℃热水预处理5min，75％的乙醇消毒1～2min，然后用无菌水漂洗一次，再用30％(v/v)次氯酸钠溶液消毒5～15min，无菌水冲洗5～6次，用无菌滤纸吸干种子表面水分，接种于1/2MS培养基中，26℃暗培养2～3d后，移至节律光照培养至形成真叶；二、剪取柱花草无菌苗的真叶，无菌条件将其切割为0.5～0.8mm的小段，接种于愈伤组织诱导培养基中，26℃暗培养；三、将培养10～15d的外植体转入继代培养基，每两周继代一次，培养至形成胚性脆性的愈伤组织；四、将基因重组人血清白蛋白转基因工程菌划线培养于含利福平50mg/L、卡那霉素50mg/L的YEP固体培养基上，在28℃培养2d，挑取单克隆加入到5ml含卡那霉素50mg/L、利福平50mg/L的YEP培养基中，在28℃，180rpm摇床培养24h后，按体积百分比1:50～1:100接种到100mL含AS100μM的YEP培养基中，28℃、180rpm摇床培养至OD600达0.6～0.8，获得活化菌液；五、取活化后的菌液3500g离心5～10min收集菌体，将菌体用愈伤组织诱导培养基重悬至OD600为0.5～0.6，将步骤三中培养的胚性愈伤组织分离为直径约0.5mm的小块，置于重悬菌液中，在恒温摇床上于28℃、180rpm浸泡2～5min，然后取出愈伤组织于无菌滤纸上吸干表面菌液，转入共培养基中，于26℃黑暗条件下共培养2～3d；六、将共培养3d后的愈伤组织用含300mg/L头孢噻肟钠(Cefotaximesodium)的MS培养基清洗1次，用无菌滤纸吸干表面多余培养基后，转入愈伤组织诱导培养基中恢复培养1周，然后转入筛选分化培养基中光照节律培养，2周继代一次至愈伤组织形成胚状体；七、将形成胚状体的抗性愈伤组织转移至不定芽分化培养基中，26℃光照节律条件下培养，2周继代一次至分化出不定芽；八、将分化出的不定芽分离，转接至生根培养基中培养，待再生植株形成后炼苗、移栽，并对再生植株进行鉴定，获得阳性植株即为转基因柱花草。人血清白蛋白具有相对稳定的结构特性，相对于原核表达体系和酵母表达体系，采用转基因柱花草作为生物反应器能更好的进行转录翻译后的修饰，以保证基因重组人血清白蛋白能正确折叠形成具有生物活性的功能蛋白。柱花草(StylosanthesguianensiasSW.)为豆科多年生草本植物，是优质的热带和亚热带牧草之一。柱花草耐热、耐低磷、耐干旱、抗虫害，耐瘠薄酸性土壤，耐践踏，不耐低温和浸渍，其根系发达，分枝多，丛生，茎匍匐或半匍匐。柱花草在盛花期的干物质中含粗蛋白质16.0～20.0％，脂肪1.6～2.0％，纤维26.0～29.0％，无氮浸出物38.0～44.0％。单播的人工草地多为刈割，用于青饲或调制干草、干草粉。中国南方如广东、广西等地，将柱花草与果树间种，除了用于饲草外，还可起到覆盖、保持水土和绿肥作用。柱花草作为优质牧草之一，具有较高的营养价值，且产量较高，可作为良好的植物生物反应器生产外源蛋白。本专利技术采用农杆菌介导法将基因重组人血清白蛋白基因导入柱花草基因组中，经筛选鉴定后获得含基因重组人血清白蛋白基因的转基因柱花草植株。目的在于通过以转基因柱花草为生物反应器规模化生产基因重组人血清白蛋白，解决人血清白蛋白在微生物发酵反应器和转基因动物中生产产量较低、存在次级代谢产物和动物源性致病原等缺陷，最终增加人血清白蛋白的提取来源，降低生产成本等。附图说明图1.基因重组人血清白蛋白植物表达载体图谱。图2.柱花草遗传转化过程。A.初生愈伤组织；B.脆性愈伤组织；C.转化后筛选培养的愈伤组织；D.抗性愈伤组织的增殖；E.抗性芽的分化；F.抗性芽的增殖；G.生根培养。图3.转基因柱花草基因组DNAPCR检测结果。A.ALB特异性引物PCR产物；B.Hyg特异性引物PCR产物。M：DL2000DNAMarker；+：质粒pCAMBIA1300-35S-ALBPCR产物(阳性对照)；-：野生型柱花草基因组DNAPCR产物(空白对照)；泳道1-7：抗性再生植株基因组DNAPCR产物。图4.转基因柱花草蛋白质检测结果。A.考马斯亮蓝染色结果；B.westernblotting检测结果。M：ProteinMarker；+：血源性人血清白蛋白(阳性对照)；-：野生型柱花草总蛋白(空白对照)；泳道1-3：抗性再生植株总蛋白。图5.转基因植株基因组DNAPCR产物第1位至第300位核苷酸测序峰图。图6.转基因植株基因组DNAPCR产物第301位至第600位核苷酸测序峰图。图7.转基因植株基因组DNAPCR产物第601位至第900位核苷酸测序峰图。图8.转基因植株基因组DNAPCR产物第601位至第1200位核苷酸测序峰图。图9.转基因植株基因组DNAPCR产物第1201位至第1500位核苷酸测序峰图。图10.转基因植株基因组DNAPCR产物第1501位至第1758位核苷酸测序峰图。具体实施方式一种用柱花草表达的基因重组人血清白蛋白及表达方法，用于本专利技术的进一步说明，但不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。具体实施方式一：本实施方式用柱花草表达的基因重组人血清白蛋白及表达方法，按以下步骤进行：一、选择籽粒饱满的柱花草种子去除褐色种皮后进行消毒处理，将去皮的种子于80℃热水预处理5本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用柱花草表达的基因重组人血清白蛋白及表达方法，其特征在于人血清白蛋白由转入了人血清白蛋白基因的转基因柱花草中表达；

【技术特征摘要】
1.一种用柱花草表达的基因重组人血清白蛋白及表达方法，其特征在于人血清白蛋白由转入了人血清白蛋白基因的转基因柱花草中表达；2.表达人血清白蛋白的转基因柱花草的制备按以下步骤进行：一、选择籽粒饱满的柱花草种子，去除褐色种皮后进行消毒处理，将去皮的种子于80℃热水预处理5min，75％的乙醇消毒1～2min，然后用无菌水漂洗一次，再用30％(v/v)次氯酸钠溶液消毒10～15min，无菌水冲洗5～6次，用无菌滤纸吸干种子表面水分，接种于1/2MS培养基中，26℃暗培养2～3d后，将萌发的种子移至节律光照培养至形成真叶；二、剪取柱花草无菌苗的真叶，无菌条件将其切割为约0.5～0.8mm的小段，接种于愈伤组织诱导培养基中，26℃暗培养；三、将培养10～15d的外植体转入继代培养基，每两周继代一次，培养至形成胚性脆性的愈伤组织；四、将基因重组人血清白蛋白转基因工程菌划线培养于含利福平50mg/L、卡那霉素50mg/L的YEP固体培养基上，在28℃培养2d，挑取单克隆加入到5ml含卡那霉素50mg/L、利福平50mg/L的YEP培养基中，在28℃，180rpm摇床培养24h后，按体积百分比1:50～1:100接种到100mL含乙酰丁香酮(Acetosyringone，AS)100μM的YEP培养基中，28℃、180rpm摇床培养至OD600达0.6～0.8，获得活化菌液；五、取活化后的菌液3500g离心5～10min收集菌体，将菌体用愈伤组织诱导培养基重悬至OD600为0.5～0.6，将步骤三中培养的胚性愈伤组织分离为直径约0.5mm的小块，置于重悬菌液中，在恒温摇床上于28℃，180rpm浸泡5～10min，然后取出愈伤组织于无菌滤纸上吸干表面菌液，转入共培养基中，于26℃黑暗条件下共培养2～3d；六、将共培养3d后的愈伤组织用含300mg/L头孢噻肟钠(Cefotaximesodium)的MS培养基清洗1次，用无菌滤纸吸干表面多余培养基后，转入愈伤组织诱导培养基中恢复培养1周，然后转入筛选分化培养基中光照节律培养，2周继代一次至愈伤组织形成胚状体；七、将形成胚...

【专利技术属性】
技术研发人员：王大勇，陈林涛，
申请(专利权)人：海南大学，
类型：发明
国别省市：海南,46