一种重塑复合生物羊膜的制备方法技术

本发明专利技术涉及医用材料制备技术领域，具体涉及一种重塑复合生物羊膜的制备方法。本发明专利技术以活性干酵母为原料得到蛋白酶，将酶解液、亚麻油酸剪切，同时添加抗坏血酸得到生物肽氧化剂，原花青素具有非常强的体内活性，能保护人体细胞组织免受自由基的氧化损伤，还具有加强和保护人体活性组织、稳定细胞膜以及抗酶活性等生物特性，本发明专利技术采用瓜尔胶与羊膜组合，羊膜中的活性蛋白的巯基受到瓜尔胶的物理屏障的保护，减少了活性基团的氧化，瓜尔胶的流变性能使不可溶的羊膜胶原成分长期地悬浮，瓜尔胶有利于羊膜低温粉碎和常温保存，具有广阔的应用前景。

A preparation method of remodeling composite biological amniotic membrane

The invention relates to the technical field of medical material preparation, in particular to a preparation method of remodeling composite biological amniotic membrane. The invention takes active dry yeast as raw material to obtain protease, shears enzymatic hydrolysate and linoleic acid, and adds ascorbic acid to obtain bio-peptide oxidant. Proanthocyanidins have very strong in vivo activity, can protect human cell tissues from free radical oxidation damage, and has biological characteristics of strengthening and protecting human active tissues, stabilizing cell membranes and resisting enzyme activity. When guar gum is combined with amniotic membrane, the sulfhydryl group of the active protein in amniotic membrane is protected by the physical barrier of guar gum, which reduces the oxidation of the active group. The rheological property of guar gum can make the insoluble components of amniotic membrane collagen suspended for a long time. Guar gum is conducive to low-temperature comminution and normal-temperature preservation of amniotic membrane, and has broad application prospects.

【技术实现步骤摘要】
一种重塑复合生物羊膜的制备方法
本专利技术涉及医用材料制备
，具体涉及一种重塑复合生物羊膜的制备方法。
技术介绍
组织粘连是结缔组织纤维带与相邻的组织或器官结合在一起而形成的异常结构，可引起各种术后并发症：例如，肌腱修复术后粘连，严重的影响手术部位功能的恢复，甚至会造成局部功能的丧失。羊膜是指人类胎盘的基底膜层，也是胎盘的最内层，光滑且具有一定的弹性，厚度约为0.02至0.5mm。羊膜是无血管、无细胞结构的胶原组织层，富含IV、V型胶原、碱性成纤维细胞生长因子、干细胞生长因子，易使上皮细胞移行长入、促进上皮的分化、增殖，在上皮创伤愈合中起重要作用。羊膜含有丰富的胶原蛋白、层粘连蛋白、纤维粘连蛋白等蛋白成分，为创伤愈合提供细胞生长的网架结构同时，也促进人体细胞的分化、分裂，从而达到快速愈合的效果。另外，羊膜中不含有血管、神经、淋巴等组织，使生物羊膜产品在临床使用后几乎不发生免疫排斥反应。此外还有来源广泛、保存简便、手术操作简单等特点，适用于烧伤、普外、眼科、内分泌等科室各类常规手术当中。羊膜具有5层结构，分别是上皮细胞层、基底膜、致密层、纤维母细胞层和海绵层。目前，羊膜主要用于外科手术中，其中包括：（1）眼睛表面疾病如角膜修复、先天性青光眼、角膜溃疡等；（2）修补鼓膜损伤；（3）用于疝修补；（4）外科手术后预防粘连；（5）烧伤后表面覆盖，用作生物敷料。传统制备得到的羊膜材料比较薄、易卷曲、黏附性较差、使用时易滑动脱落。为了克服上述缺点，目前采用交联技术制备复合生物衍生羊膜以改善其可操作性，但处理时使用了氯仿、甲醇、戊二醛等多种有机试剂，处理强度大，经过脱脂等多个步骤后对羊膜的天然结构破坏很大，造成胶原束排列不规则，胶原纤维断裂，同时大量的生物活性因子失活，试剂残留风险高。根据临床报道，由于羊膜细胞的存在，在眼科，羊膜植片可能会发生植片排斥反应、植片脱落、移位溶解、感染等并发症，其安全性存在一定的风险。为了降低产品的的免疫原性，就需要对羊膜进行脱细胞处理。目前对于羊膜的处理方法大多为临时剥离处理的新鲜羊膜，或者经过预处理的深低温保存羊膜，但两者均不能做到随取随用。还有一种技术是将羊膜预处理后真空冷冻干燥，灭菌包装储存，该种方式能够做到随取随用，延长保存期到1～3年。目前对于羊膜的处理方法容易使羊膜损失大量天然胶原及活性因子，对羊膜临床使用效果造成了极为不利的影响，同时存在细胞残留、机械性能不足以及降解周期较短等缺陷，限制了其临床应用范围。而且处理过的羊膜材料，极少能完全取出细胞等抗原成分，因此仍具有一定的抗原性，有可能在使用时引发炎症。此外，单层的羊膜或羊膜材料较薄，机械强度较差，易撕裂，手术中操作困难，不利于临床使用和研究。因此，能够研制出一种能够解决上述问题的生物羊膜具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术主要解决的技术问题，针对目前生物羊膜在反复冻融、干燥和脱细胞等工艺处理过程中，羊膜中大量天然胶原及活性因子易被氧化，并且有机化学试剂会破坏胶原蛋白、胶原纤维等成分，造成生物羊膜生物性功能不能满足临床要求的缺陷，提供了一种重塑复合生物羊膜的制备方法。为了解决上述技术问题，本专利技术所采用的技术方案是：一种重塑复合生物羊膜的制备方法，其特征在于具体制备步骤为：（1）取胎盘置于无菌工作台，将羊膜连同绒毛膜自胎盘上钝性分离后用生理盐水清洗血渍，得到洁净的羊膜，再用庆大霉素洗涤后放入DMEM培养基中培养4～5天，培养结束后冰冻储存，得到预处理的羊膜，备用；（2）将活性干酵母加水配制成酵母乳，用柠檬酸钠溶液调节酵母乳的pH，加热升温，加入酵母乳质量0.5%的混合蛋白酶，酶解得到酶解液；（3）按重量份数计，将40～50份上述酶解液、20～25亚麻油酸混合置于高速剪切机中，同时添加4～5份抗坏血酸，剪切乳化20～25min，得到混合乳液，将混合乳液放入旋蒸仪中，旋蒸10～15min，取下旋蒸瓶置于真空干燥箱中干燥，得到生物肽氧化剂；（4）取葡萄籽置于蒸馏水中，进行超声波破碎提取，再转移至离心分离机中，离心后用微孔滤膜器过滤，去除滤渣，得到滤液，将滤液放入冷冻干燥机中冻干，得到葡萄籽冻干提取物；（5）将瓜尔胶溶解于柠檬酸/柠檬酸钠缓冲溶液中，制得瓜尔胶溶液，将预处理的羊膜置于瓜尔胶溶液中，随后将瓜尔胶溶液、生物肽氧化剂、葡萄籽干提取物混合，置于球磨机中进行磨碎处理3～4h，球磨完毕后在冰水浴下过200目筛，得到过滤液，将过滤液用流延设备制成生物羊膜，流延过程中用高能电子束辐照。步骤（1）所述的庆大霉素的浓度为4～5×106U/L，DMEM培养基中青霉素和链霉素的含量为100～120×103U/L，小牛血清的体积分数为10%，冰冻储存温度为-25～-20℃。步骤（2）所述的酵母乳的质量分数为15%的，柠檬酸钠溶液质量分数为20%，调节酵母乳的pH为4.5～5.0，加热升温后温度为50～55℃，混合蛋白酶由木瓜蛋白酶和细菌蛋白酶按质量比2:1混合而成，酶解时间为4～6h。步骤（3）所述的剪切乳化转速为3000～4000r/min，旋蒸温度为90～110℃，真空干燥箱设定温度为50～60℃，干燥时间为3～4h。步骤（4）所述的超声波破碎提取时控制提取温度为70～80℃，超声频率为30～35kHz，离心转速为3000～3500r/min，微孔滤膜器孔径为0.22～0.25μm，冷冻干燥温度为-60～-50℃。步骤（5）所述的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲溶液浓度为0.1mol/L、pH为6.6～6.8，瓜尔胶溶液的质量分数为1%，羊膜置于瓜尔胶溶液时控制羊膜与瓜尔胶的质量比为1︰1，瓜尔胶溶液、生物肽氧化剂、葡萄籽干提取物混合质量比为50︰5︰1，球磨时温度为-90～-80℃，高能电子束辐照时剂量为20～25kGy，流延设备温度控制为-25～-20℃。本专利技术的有益效果是：（1）本专利技术将活性干酵母配制成酵母乳，用柠檬酸钠溶液调节pH，加热处理并添加混合蛋白酶，酶解得到酶解液，最后将酶解液、亚麻油酸混合剪切，同时添加抗坏血酸防氧化，得到混合乳液，经过旋蒸处理后，真空干燥旋蒸瓶，得到生物肽氧化剂，所用的葡萄籽中含有多酚类物质，主要有儿茶素类和原花青素类抗氧化活性成分，制备的葡萄籽提取物中主要成分为原花青素（OPC），原花青素具有非常强的体内活性，OPC的抗自由基氧化能力是维生素E的50倍，维生素C的20倍，OPC能有效清除体内多余的自由基，保护人体细胞组织免受自由基的氧化损伤，防治过敏、癌症、衰老等100多种与自由基有关的疾病，还具有加强和保护人体活性组织、稳定细胞膜以及抗酶活性等生物特性，因而将葡萄籽提取物用于生物羊膜中天然胶原和活性因子的抗氧化性保护，效果显著，此外，OPC还具有很好的生物利用度，易于被人体吸收，其它的抗氧化剂如胡萝卜素、超氧化物岐化酶不是效力太弱就是没有体内活性，葡萄籽精华含丰富生物类黄酮，是强力的精华分子，用于对抗自由基与维护微丝血管的健康，应用于结膜重建时防老化作用显著，利用亚麻油酸提高葡萄籽提取物和生物肽的油溶性能，并且在氧气因素作用下，发生氧化反应生成烷基自由基和烷基过氧自由基，这些烷基自由基和烷基过氧自由基与葡萄籽提取物中酚酸类物质和活性生物肽反应生成氮自由基和活性较低的醇和酸类化合物，氮自由基在苯环共轭本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种重塑复合生物羊膜的制备方法，其特征在于具体制备步骤为：（1）取胎盘置于无菌工作台，将羊膜连同绒毛膜自胎盘上钝性分离后用生理盐水清洗血渍，得到洁净的羊膜，再用庆大霉素洗涤后放入DMEM培养基中培养4～5天，培养结束后冰冻储存，得到预处理的羊膜，备用；（2）将活性干酵母加水配制成酵母乳，用柠檬酸钠溶液调节酵母乳的pH，加热升温，加入酵母乳质量0.5%的混合蛋白酶，酶解得到酶解液；（3）按重量份数计，将40～50份上述酶解液、20～25亚麻油酸混合置于高速剪切机中，同时添加4～5份抗坏血酸，剪切乳化20～25min，得到混合乳液，将混合乳液放入旋蒸仪中，旋蒸10～15min，取下旋蒸瓶置于真空干燥箱中干燥，得到生物肽氧化剂；（4）取葡萄籽置于蒸馏水中，进行超声波破碎提取，再转移至离心分离机中，离心后用微孔滤膜器过滤，去除滤渣，得到滤液，将滤液放入冷冻干燥机中冻干，得到葡萄籽冻干提取物；（5）将瓜尔胶溶解于柠檬酸/柠檬酸钠缓冲溶液中，制得瓜尔胶溶液，将预处理的羊膜置于瓜尔胶溶液中，随后将瓜尔胶溶液、生物肽氧化剂、葡萄籽干提取物混合，置于球磨机中进行磨碎处理3～4h，球磨完毕后在冰水浴下过200目筛，得到过滤液，将过滤液用流延设备制成生物羊膜，流延过程中用高能电子束辐照。...

【技术特征摘要】
1.一种重塑复合生物羊膜的制备方法，其特征在于具体制备步骤为：（1）取胎盘置于无菌工作台，将羊膜连同绒毛膜自胎盘上钝性分离后用生理盐水清洗血渍，得到洁净的羊膜，再用庆大霉素洗涤后放入DMEM培养基中培养4～5天，培养结束后冰冻储存，得到预处理的羊膜，备用；（2）将活性干酵母加水配制成酵母乳，用柠檬酸钠溶液调节酵母乳的pH，加热升温，加入酵母乳质量0.5%的混合蛋白酶，酶解得到酶解液；（3）按重量份数计，将40～50份上述酶解液、20～25亚麻油酸混合置于高速剪切机中，同时添加4～5份抗坏血酸，剪切乳化20～25min，得到混合乳液，将混合乳液放入旋蒸仪中，旋蒸10～15min，取下旋蒸瓶置于真空干燥箱中干燥，得到生物肽氧化剂；（4）取葡萄籽置于蒸馏水中，进行超声波破碎提取，再转移至离心分离机中，离心后用微孔滤膜器过滤，去除滤渣，得到滤液，将滤液放入冷冻干燥机中冻干，得到葡萄籽冻干提取物；（5）将瓜尔胶溶解于柠檬酸/柠檬酸钠缓冲溶液中，制得瓜尔胶溶液，将预处理的羊膜置于瓜尔胶溶液中，随后将瓜尔胶溶液、生物肽氧化剂、葡萄籽干提取物混合，置于球磨机中进行磨碎处理3～4h，球磨完毕后在冰水浴下过200目筛，得到过滤液，将过滤液用流延设备制成生物羊膜，流延过程中用高能电子束辐照。2.根据权利要求1所述的一种重塑复合生物羊膜的制备方法，其特征在于：步骤（1）所述的庆大霉素的浓度为4～5×106U/L，DMEM培养基中青霉素和链霉素的含量为100...

【专利技术属性】
技术研发人员：谭亚，章红英，赵金晶，
申请(专利权)人：谭亚，
类型：发明
国别省市：江苏,32