一种用于制备三维软骨类器官块的方法技术

本发明专利技术提供通过将间充质干细胞分化成三维球状软骨组织，三维软骨球状块的基本单位，而制备的三维软骨类器官块。发明专利技术人发现，GAG基质的量和胶原蛋白2型的表达均增加。因此，本发明专利技术的方法通过根据二维培养物有效地增强软骨分化构建体的功能来提供临床上可应用的软骨组织。所述三维软骨类器官块可以有用地应用于诸如，需要软骨组织恢复的关节软骨再生和整形手术的领域。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】一种用于制备三维软骨类器官块的方法
本专利技术涉及制备人造组织。本专利技术直接涉及体外制备人造软骨组织的方法。
技术介绍
老龄化以及社交和体育活动的增加导致患有软骨损伤的患者数量增加，因此开发恢复受损软骨的医学技术的需求也在增加。然而，由于软骨组织没有血管并且软骨细胞的运动性受到细胞外基质(ECM)的限制，所以难以轻松地使受损的软骨再生。在目前治疗受损软骨的方法中，人造关节置换具有缓解疼痛的优点，并且在成功完成手术时能使患者自然地行走。由于与人造关节置换相关的技术近来得到了很大的改进，人造关节置换手术被用于治疗严重损伤的软骨。此外，微创人工关节置换手术有助于人工关节的寿命延长并从手术中快速恢复。然而，人造关节手术在各个方面仍然是患者的负担。人造关节的磨损限制了人造关节的寿命，并且耐用性取决于管理和手术的结果。进一步地，如果手术过程中存在细菌感染，则需要再次手术。进一步地，在骨切割手术期间存在副作用或并发症的风险。因此，对使用细胞(employeecells)的再生医疗解决方案的需求不断提高。在这方面，已经开发了使用从患者自身获得的细胞进行自体软骨细胞植入(aci)、异体软骨细胞植入以及通过将自体和/或异种干细胞分化为软骨细胞来开发治疗剂的研究。自体和/或异体软骨细胞植入具有由软骨细胞培养引起的去分化问题，因此无法获得用于有效治疗的足够数量的细胞。使用间充质干细胞的治疗具有提供足够数量的细胞的优点。尽管目前还没有完善的软骨分化方法，但近来已经开发了大量技术。应当开发诸如软骨细胞生存力增强、表型维持和机械强度保持等技术，以使得使用细胞的治疗方法成功。迄今为止，已经引入了各种方法以克服上述问题(韩国专利登记No.10-1367221)，例如通过使用三维支撑物(诸如，水凝胶)来增强细胞粘附率，通过控制周围微环境来维持更多天然软骨组织，保持对外部压力的弹性。然而，诸如细胞和生物材料之间的相互作用、生物相容性以及尤其是与邻近软骨的结合等问题尚未解决。近来，在不使用支持物的情况下，细胞被制备成高密度三维小球。这种球状体成形方法具有制备工艺简单和容易重复的优点。尽管开发了使用96孔的细胞群培养技术，其在每个单孔中包含一个球状体，但是很难在结构上形成球状体彼此融合处的一个组织。用诸如水凝胶的生物材料制备软骨组织是不可能的，因此难以用常规技术制备治疗剂。KR专利No.10-1109668公开了使用介孔PLGA-二氧化硅支架，从脂肪干细胞分化的骨用于组织工程，KR专利No.10-0839875公开了关于用于关节软骨再生的支架的专利技术，其中，支架是通过将细胞接种到包含可生物降解聚合物和磷酸钙生物相容性陶瓷的介孔支架中而制备。
技术实现思路
专利技术人已经研究了用于制备三维软骨类器官块的新方法以解决上述问题。结果，我们首先发现，在相互接触的三维球状软骨组织分化为软骨的情况下，组织彼此连接以提供大的三维软骨类器官块。其次，当通过将三维球状软骨组织(间充质干细胞构建体或在间充质干细胞向软骨细胞分化的中间步骤中的构建体)加载在二维高密度软骨分化细胞层(间充质干细胞或由间充质干细胞分化的软骨细胞的中间状态的细胞层)的中心部分上，来持续诱导软骨分化时，我们发现二维高密度软骨分化细胞层自组装以环绕三维球状软骨组织，从而形成结构致密的三维软骨类器官块。就此而言，本专利技术提供了一种制备三维软骨类器官块的方法，其通过融合和连接三维球状软骨组织本身，或通过在三维球状软骨组织存在下诱导二维软骨分化细胞层的自组装，所述三维球状软骨组织通过间充质干细胞分化成三维球体状态软骨组织而制备，其中通过在二维平板上将间充质干细胞分化成高密度软骨组织来制备二维软骨细胞层。另外，本专利技术的目的是将三维软骨类器官块用于需要软骨修复的任何区域或领域。本专利技术的目的是提供一种制备三维软骨类器官块的方法，其包括以下步骤：(a)通过间充质干细胞的三维培养使所述间充质干细胞分化成三维球状软骨组织；(b)通过间充质干细胞的二维培养使所述间充质干细胞分化成二维软骨分化细胞层；和(c)在所述二维软骨分化细胞层上孵育所述三维球状软骨组织以诱导自组装。间充质干细胞包括源自脂肪、骨髓、脐带(cord)、脐带血、胎盘、滑膜、骨膜、软骨膜、扁桃体、皮肤、毛囊、外周血、肌肉、肝脏、神经元组织、胎膜、羊膜、半月板或前十字韧带的细胞。本专利技术的方法进一步包括通过融合和培养三维球状软骨组织来制备三维球状体融合构建体的步骤。三维球状体融合构建体可以通过自然融合、使用生物相容性胶融合或使用缝合纤维融合来制备。可以使用含有三维球状体的生物相容性聚合物支架，通过融合和培养不同的三维球状软骨组织来制备三维球状体融合构建体。与常规软骨分化方法相比，本专利技术提供了用于制备三维软骨类器官的结构大且致密且功能上有效的三维软骨组织。进一步地，可以通过被认为是小功能单元的三维球状软骨组织的自组装的融合来制备更多类人软骨组织。进一步地，本专利技术结合了常规软骨分化方法的有利特点。具体地，高密度的二维软骨分化的细胞层通过自组装与板分离，并因此包含细胞自身ECM，引起三维球状体软骨组织之间的间隙的有效填充和提高其生物相容性。进一步地，由于三维球状软骨组织在结构上是致密的，所以其起到支柱作用以增强强度。在这点上，本专利技术使得制备治疗剂成为可能，所述治疗剂在植入到患者的软骨损伤的部分或附加软骨是必要的身体的部分时，增强了强度并增加了生物相容性。附图说明图1示出3种干细胞阳性标志物[CD44(+)，CD105(+)，CD29(+)]和2种阴性标志物[CD34(-)，CD45(-)]的FACS分析结果，以评估间充质干细胞的干性；图2示出ECM标志物(col2，聚集蛋白聚糖)表达的qRT-PCR分析结果。在二维培养条件下将间充质干细胞分化成软骨细胞，并使用阿尔新蓝染色定量分析软骨分化标志物GAG的表达；图3示出制备三维软骨类器官的整个过程，其中三维球状软骨组织由脂肪来源的间充质干细胞产生；图4分别是用于评估三维球状体融合构建体和三维软骨类器官的软骨分化能力的阿尔新蓝免疫染色(A)和II型胶原(B)的qRT-PCR的结果具体实施方式本专利技术涉及一种用于制备三维软骨类器官块的方法，其特征在于：(a)将间充质干细胞三维培养并分化成三维球状软骨组织；(b)将间充质干细胞二维培养并分化成二维软骨分化细胞层；和(c)在二维软骨分化细胞层上孵育三维球状软骨组织以诱导自组装。在本专利技术中，术语“二维细胞培养”是指细胞在平板上以一层培养，而术语“三维培养”是指细胞与其他相邻细胞在三维上培养。所述间充质干细胞包括源自脂肪、骨髓、脐带、脐带血、胎盘、滑膜、骨膜或软骨膜的细胞。在本专利技术中，术语“软骨细胞”是指通过包括人的动物的干细胞的分化而获得的软骨细胞，并且进一步包括从软骨组织培养的软骨细胞。所述干细胞优选指成人间充质干细胞、胚胎干细胞、多能干细胞和未分化祖细胞等。所述软骨细胞优选指获自人软骨组织的在体外的软骨细胞，和更优选提及从人正常软骨玻璃化(vitrification)获得的在体外的软骨细胞。除步骤(a)将间充质干细胞三维培养并分化成三维球状软骨组织；(b)将间充质干细胞二维培养并分化成二维软骨分化细胞层；和(c)在二维软骨分化细胞层上孵育三维球状软骨组织以诱导自组装之外，本发本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于制备三维软骨类器官块的方法，所述方法包括以下步骤，(a)将间充质干细胞三维培养并分化成三维球状软骨组织；(b)将间充质干细胞二维培养并分化成二维软骨分化细胞层；和(c)在所述二维软骨分化细胞层上孵育所述三维球状软骨组织以诱导自组装。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.12.30 KR 10-2015-01895051.一种用于制备三维软骨类器官块的方法，所述方法包括以下步骤，(a)将间充质干细胞三维培养并分化成三维球状软骨组织；(b)将间充质干细胞二维培养并分化成二维软骨分化细胞层；和(c)在所述二维软骨分化细胞层上孵育所述三维球状软骨组织以诱导自组装。2.根据权利要求1所述的用于制备三维软骨类器官块的方法，其中，所述间充质干细胞包括源自脂肪、骨髓、脐带、脐带血、胎盘、滑膜、骨膜...

【专利技术属性】
技术研发人员：申永基，朴相奎，金永德，安钟赞，朴炳俊，李锡逸，
申请(专利权)人：艾克斯赛尔治疗公司，
类型：发明
国别省市：韩国,KR