一种单细胞测序前样品处理装置、微流控芯片及应用制造方法及图纸

本发明专利技术实施例提供了一种单细胞测序前样品处理装置，包括第一主流道、第二主流道和至少一个样品处理单元；所述第一主流道上设有至少一条分支流道，所述第一主流道的两端分别设有一个样品输入口和一个样品输出口；每条所述分支流道上设有一个所述样品处理单元，所述样品处理单元包括依次连通的细胞捕获腔室、核酸释放腔室、中和反应腔室和液滴生成腔室；其中，每相邻两腔室之间均设有控制阀；所述第二主流道与每个所述样品处理单元中的所述细胞捕获腔室相连通，所述第二主流道上设有一细胞输入口。该装置可以高效的实现单细胞全基因组扩增，大大提升单细胞全基因组扩增反应的均一性和准确性问题。本发明专利技术还提供了一种微流控芯片及应用。

A Sample Processing Device, Microfluidic Chip and Its Application before Single Cell Sequencing

The embodiment of the invention provides a sample processing device before single cell sequencing, including a first main channel, a second main channel and at least one sample processing unit; the first main channel is provided with at least one branch channel, and the two ends of the first main channel are respectively provided with a sample input port and a sample output port; and each branch channel is provided with a sample location. The sample processing unit comprises a sequentially connected cell capture chamber, a nucleic acid release chamber, a neutralization reaction chamber and a droplet formation chamber, in which a control valve is arranged between each adjacent two chambers, and the second main channel is connected with the cell capture chamber in each sample processing unit, and a cell input port is arranged on the second main channel. The device can efficiently amplify the whole genome of a single cell, and greatly improve the homogeneity and accuracy of the whole genome amplification response of a single cell. The invention also provides a microfluidic chip and application.

【技术实现步骤摘要】
一种单细胞测序前样品处理装置、微流控芯片及应用
本专利技术涉及微流控
，特别是涉及一种单细胞测序前样品处理装置、微流控芯片及应用。
技术介绍
单细胞全基因组测序(简称单细胞测序)技术是在单细胞水平对全基因组进行扩增与测序的一项新技术；其原理是将分离的单个细胞的全基因组DNA进行扩增，获得高覆盖率的完整的基因组之后，通过外显子捕获高通量测序用于揭示细胞群体的差异关系。近年来，对单个细胞基因组DNA进行扩增应用的最普遍、最简单的方法是多重置换扩增(multipledisplacementamplification，MDA)技术，该技术利用随机引物和等温扩增可以获得大量高保真的DNA片段，但是存在扩增偏倚及非特异扩增等问题；另外，还有简并寡核苷酸引物聚合酶链反应(degenerateoligonucleotideprimedPCR，DOP-PCR)，由于其基因覆盖率比较低，不能检测单个核苷酸的变异；而基于多重退火和循环的扩增循环(MultipleAnnealingandLoopingBasedAmplificationCycles，MALBAC)方法虽然能够抑制扩增偏倚，但是保真性较差，操作步骤相对复杂，不利于进行高通量的全基因组扩增(WGA)。更棘手的问题是以上方法均为人工操作，步骤繁琐，误差较大。单细胞测序技术的流程主要包括单细胞分离、细胞溶解与基因组DNA获取、全基因组扩增(whole-genomeamplification，WGA)、测序与数据分析四个方面。目前，采用的新一代测序技术中，绝大多数方法都需要对样品进行特定的前处理，目前使用的测序建库方法大多数需要用的DNA量为ng到μg量级，而单个细胞所含有的遗传物质太少(例如，单个哺乳细胞的总DNA含量一般为6pg)；因此，在单细胞基因测序前需要对单细胞全基因组扩增，以获得足够样本量。单细胞测序技术中的全基因组扩增是一个大考验，面对如此微量的单细胞遗传物质，任何生化反应不均一、分子降解或丢失现象都会对测序质量带来非常严重的影响，特别是针对珍贵实验样品。例如早期胚胎的细胞，数量稀少；为了从这些极其宝贵的细胞中尽可能地获取有价值的信息，需要在制备文库前进行一次扩增。但是，在这一过程中，遗传物质容易降解丢失或者受到外源污染，使操作的困难程度大大增加，给科研工作者在进一步了解单细胞层次上的异质性及其生物医学意义带来了巨大挑战。目前已经报导的全基因组扩增PCR原始量如果降低到单个细胞，均无法得到准确的扩增，因此存在明显的技术壁垒。同时，现有方法技术中，大多数单细胞测序覆盖率大约达到基因组的40％-70％。因此，发展一种能够有效实现单细胞全基因组扩增的自动化和集成化方法，以解决单细胞全基因组扩增反应的均一性和准确性难题具有重大意义。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术实施例一种单细胞测序前样品处理装置、微流控芯片及应用，所述单细胞测序前样品处理装置能够实现单细胞捕获和全基因组扩增反应，采用大量的液滴微反应体系，可以高效的实现单细胞全基因组扩增，大大提升单细胞全基因组扩增反应的均一性和准确性问题。第一方面，本专利技术提供了一种单细胞测序前样品处理装置，包括第一主流道、第二主流道和至少一个样品处理单元；所述第一主流道上设有至少一条分支流道，所述第一主流道的两端分别设有一个样品输入口和一个样品输出口；每条所述分支流道上设有一个所述样品处理单元，所述样品处理单元包括依次连通的细胞捕获腔室、核酸释放腔室、中和反应腔室和液滴生成腔室，所述细胞捕获腔室、所述核酸释放腔室、所述中和反应腔室和所述液滴生成腔室中的每相邻两腔室之间均设有控制阀；所述第二主流道与每个所述样品处理单元中的所述细胞捕获腔室相连通，所述第二主流道上设有一细胞输入口。可选地，所述液滴生成腔室包括连续相腔室和分散相腔室，所述分散相腔室与所述中和反应腔室相连通，所述分散相腔室与所述连续相腔室之间设有一分离隔板，所述分离隔板上设有多条连通所述分散相腔室与所述连续相腔室的微通道；所述连续相腔室设有至少一出入口，所述出入口用于连续相流体的输入或输出；从所述中和反应腔室流出的分散相流体经多条所述微通道流出形成液滴，所述液滴分散至所述连续相腔室内的连续相流体中。可选地，所述液滴生成腔室包括连续相腔室和分散相腔室，所述分散相腔室与所述中和反应腔室相连通，所述分散相腔室与所述连续相腔室之间设有一分离隔板，所述分离隔板上设有多条连通所述分散相腔室与所述连续相腔室的微通道；所述连续相腔室设有至少一个连续相输入口和至少一个连续相输出口；从所述中和反应腔室流出的分散相流体经多条所述微通道流出形成液滴，所述液滴分散至所述连续相腔室内的连续相流体中。可选地，多条所述微通道均匀分布在所述分离隔板上。可选地，所述分离隔板包括相对设置的第一端面和第二端面，所述第一端面朝向所述连续相腔室，所述第二端面朝向所述分散相腔室，所述微通道在所述第一端面上形成有第一开口，所述微通道在所述第二端面上形成有第二开口；所述第一端面上且沿所述第一开口的边缘设有一圈凹槽。可选地，所述细胞捕获腔室包括液体通道及设置于所述液体通道中的单细胞分离结构，所述单细胞分离结构包括细胞过滤筛和细胞吸附部中的一种或多种。本专利技术第一方面所述的单细胞测序前样品处理装置，可以高效地实现单细胞的捕获及分离，并可以进一步对单细胞进行裂解及全基因组扩增；所述液滴生成腔室可以高通量、高效的生成液滴，通过高高通量的液滴微反应可以极大地对单细胞的全基因组进行扩增，避免生化反应不均一、分子降解或丢失现象的发生，有效保证单细胞全基因组扩增反应的均一性和准确性。第二方面，本专利技术提供了一种包括本专利技术第一方面所述的单细胞测序前样品处理装置的微流控芯片，所述微流控芯片包括基板和依次封接在所述基板上的反应流道层和控制层，所述第一主流道、所述第二主流道和至少一个所述样品处理单元均设置在所述反应流道层内，所述控制层上分别设有与所述样品输入口、所述细胞输入口和所述样品输出口对应的通孔，所述控制阀分别对应设置在所述控制层上。可选地，所述基底和所述反应流道层一体成型。可选地，在所述控制层上设有多个与所述第二主流道对应的控制阀，所述第二主流道对应的控制阀用于分别控制所述第二主流道与每个所述样品处理单元中的所述细胞捕获腔室之间的分隔与连通。本专利技术第二方面所述的微流控芯片，基于微流控技术，具有尺寸小、试剂消耗量少、高通量、易集成等特点，可以实现对实验样品集成化快速处理。由于利用微加工技术，尺寸远小于采用传统方式的捕获结构和反应腔室，可以同时捕获多了个目的细胞，并同时进行全基因组的扩增，相比传统手工操作方法，大大简化操作步骤；同时，由于所述微流控芯片的液滴生成腔室较小，可以促使反应更加充分，大大节省常规基因扩增所用试剂盒反应所需时间。此外，所述微流控芯片，可以根据需要设计多条并联的分支通道及样品处理单元，并能实现单细胞样品的同时前处理，大大提高单细胞测序前样品处理效率。第三方面，本专利技术提供了一种利用如本专利技术第一方面所述的单细胞测序前样品处理装置进行单细胞测序前样品处理的方法，包括：(1)从所述样品输入口通入细胞裂解液以使所述单细胞进行裂解后，停止所述细胞悬液的通入；(2)从所述样品输入口通入细胞裂解液以使所述单细胞进行裂解后，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种单细胞测序前样品处理装置，其特征在于，包括第一主流道、第二主流道和至少一个样品处理单元；所述第一主流道上设有至少一条分支流道，所述第一主流道的两端分别设有一个样品输入口和一个样品输出口；每条所述分支流道上设有一个所述样品处理单元，所述样品处理单元包括依次连通的细胞捕获腔室、核酸释放腔室、中和反应腔室和液滴生成腔室，所述细胞捕获腔室、所述核酸释放腔室、所述中和反应腔室和所述液滴生成腔室中的每相邻两腔室之间均设有控制阀；所述第二主流道与每个所述样品处理单元中的所述细胞捕获腔室相连通，所述第二主流道上设有一细胞输入口。

【技术特征摘要】
1.一种单细胞测序前样品处理装置，其特征在于，包括第一主流道、第二主流道和至少一个样品处理单元；所述第一主流道上设有至少一条分支流道，所述第一主流道的两端分别设有一个样品输入口和一个样品输出口；每条所述分支流道上设有一个所述样品处理单元，所述样品处理单元包括依次连通的细胞捕获腔室、核酸释放腔室、中和反应腔室和液滴生成腔室，所述细胞捕获腔室、所述核酸释放腔室、所述中和反应腔室和所述液滴生成腔室中的每相邻两腔室之间均设有控制阀；所述第二主流道与每个所述样品处理单元中的所述细胞捕获腔室相连通，所述第二主流道上设有一细胞输入口。2.如权利要求1所述的单细胞测序前样品处理装置，其特征在于，所述液滴生成腔室包括连续相腔室和分散相腔室，所述分散相腔室与所述中和反应腔室相连通，所述分散相腔室与所述连续相腔室之间设有一分离隔板，所述分离隔板上设有多条连通所述分散相腔室与所述连续相腔室的微通道；所述连续相腔室设有至少一出入口，所述出入口用于连续相流体的输入或输出；从所述中和反应腔室流出的分散相流体经多条所述微通道流出形成液滴，所述液滴分散至所述连续相腔室内的连续相流体中。3.如权利要求1所述的单细胞测序前样品处理装置，其特征在于，所述液滴生成腔室包括连续相腔室和分散相腔室，所述分散相腔室与所述中和反应腔室相连通，所述分散相腔室与所述连续相腔室之间设有一分离隔板，所述分离隔板上设有多条连通所述分散相腔室与所述连续相腔室的微通道；所述连续相腔室设有至少一个连续相输入口和至少一个连续相输出口；从所述中和反应腔室流出的分散相流体经多条所述微通道流出形成液滴，所述液滴分散至所述连续相腔室内的连续相流体中。4.如权利要求2或3所述的单细胞测序前样品处理装置，其特征在于，所述分离隔板包括相对设置的第一端面和第二端面，所述第一端面朝向所述连续相腔室，所述第二端面朝向所述分散相腔室，所述微通道在所述第一端面上形成有第一开口，所述微通道在所述第二端面上形成有第二开口；所述第一端面上且沿所述第一开口的边缘设有一圈凹槽。5.如权利要求1所述的单细胞测序前样品处理装置，其特征在于，所述细胞捕获腔室包括液体通道及设置于所述液体通道中的单细胞分离结构，所述单细胞分离结构包括细胞过滤筛和细胞吸附部中的一种或多种。6...

【专利技术属性】
技术研发人员：张宝月，陈艳，
申请(专利权)人：深圳先进技术研究院，
类型：发明
国别省市：广东,44