一种抗HER2多克隆抗体制造技术

本发明专利技术公开了一种抗HER2的多克隆抗体,所述多克隆抗体通过如下方法制备得到：(1)制备得到HER2抗体，并进行纯化；(2)将前述的HER2抗体作为抗原对动物进行多次免疫，收集动物每次被免疫后的血清样本，(3)将所述各个血清样本进行ELISA效价检测，(4)选择效价大于1:2000K数值的血清样本，进行收集，并进行初步纯化，(5)将初步纯化的血清样本，进一步进行亲和柱层析纯化。本发明专利技术的抗Her2多克隆抗体，不仅具有高特异性、高灵敏度，且具有较高的效价，给Her2抗体的检测提供了很好的优质抗体。

A polyclonal antibody against HER2

The invention discloses a polyclonal antibody against HER2. The polyclonal antibody is prepared by the following methods: (1) preparing and purifying the HER2 antibody; (2) immunizing the animal with the HER2 antibody as an antigen for several times, collecting the serum samples of the animal after each immunization; (3) detecting the ELISA titer of the various serum samples; (4) selecting the titer greater than 1:2000K. Number of serum samples were collected and preliminarily purified. (5) Preliminary purified serum samples were further purified by affinity column chromatography. The anti-Her2 polyclonal antibody of the invention not only has high specificity, high sensitivity, but also has high titer, which provides a good quality antibody for the detection of Her2 antibody.

【技术实现步骤摘要】
一种抗HER2多克隆抗体
本专利技术涉及免疫生物
，具体涉及一种抗Her2抗体及其制备方法。
技术介绍
乳腺癌是女性最为常见的恶性肿瘤之一。全世界每年新增100万以上的乳腺癌病例，而且每年近40万人死于乳腺癌。近年来，乳腺癌的发病率在世界范围内呈明显的上升趋势。乳腺癌通常的治疗手段有手术治疗、放化疗和内分泌治疗等等，这些常规治疗手段虽然在很大程度上延长了病人生存期，然而它们副作用很大，其疗效难以进一步提高。肿瘤靶向治疗是近年来兴起的一种新的肿瘤治疗方式，其中具有代表性的是抗肿瘤单克隆抗体。HER2受体(humanepidermalgrowthfactorreceptor2人表皮生长因子受体II,)是一种具有酪氨酸激酶活性的跨膜蛋白，由922个腺嘌呤、1,382个胞嘧啶、1,346个鸟嘌呤和880个胸腺嘧啶组成。分子量约为185KD。抗HER2单克隆抗体可以特异性地和HER2分子结合，其抗肿瘤机制包括以下几点:特异结合于HER2受体胞外段从而阻断HER2同源二聚体的组成性激活并干扰HER2与其家族其它成员形成异源二聚体。介导HER2受体的内吞和在溶酶体中的降解；活化PTEN(与tensin同源的磷酸酯酶)阻断PI3K(磷酸肌醇3-激酶)信号通路；调节细胞周期而抑制肿瘤细胞增殖；促进肿瘤细胞凋亡；抗肿瘤血管生成；ADCC(抗体依赖细胞介导的细胞毒性作用)作用；抑制DNA修复；增加化疗药物的细胞毒性；逆转肿瘤细胞对宿主细胞因子杀伤作用的抵抗等。HER2受体蛋白一般在胎儿时期表达，成年后会在极少数组织低表达。根据目前研究表明，30％以上的人类肿瘤中存在HER2基因的扩增/过度表达(如乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、输卵管癌、胃癌和前列腺癌等)；其中20％－30％的原发性浸润性乳腺癌有HER2基因的扩增/过度表达。有研究表明HER2的过度表达与肿瘤的发生和侵袭有关，可提高转移的危险。HER2过度表达的乳腺癌患者病情进展迅速，化疗缓解期短，内分泌治疗效果差，无病生存和总生存率低。则以HER2为靶点的治疗性单抗以其高特异性、定向性、安全性和低风险成为了针对Her2阳性乳腺癌的有效治疗方法。而在欧美发达等国家对于重组单抗技术的封锁和垄断，造成进口药物的价格昂贵。这就使得国内患者可选择者性单一或者支付不起。根据调查研究表明，大多数乳腺癌死亡病例(69％)发生在发展中国家。目前针对HER2引起疾病的疫苗、特异性治疗药物等防控手段尚在研制中。HER2的抗原含量检测、保护性表位研究、治疗性单克隆抗体的制备，具有广泛的应用范围和社会需求。高质量的HER2单克隆抗体(mAb)有可能用于研制治疗性mAb、HER2患者血清学诊断以及HER2的抗原含量的检测，因此具有重要的应用价值。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种用于检测HER2抗体的方法，并提供一种抗HER2的多克隆抗体。为解决上述技术问题，本专利技术提供一种抗HER2的多克隆抗体,所述多克隆抗体通过如下方法制备得到：(1)制备得到HER2抗体，并进行纯化；(2)将前述的HER2抗体作为抗原对动物进行多次免疫，收集动物每次被免疫后的血清样本，(3)将所述各个血清样本进行ELISA效价检测，(4)选择效价大于1:2000K数值的血清样本，进行收集，并进行初步纯化，(5)将初步纯化的血清样本，进一步进行亲和柱层析纯化。优选地，所述HER2抗体作为抗原至少免疫动物两次，优选地，免疫三次至六次。优选地，所述HER2抗体包括鼠源HER2抗体，嵌合HER2抗体，改型HER2抗体，全人源化HER2抗体和表面重塑人源化HER2抗体。优选地，所述HER2抗体的氨基酸序列如SeqIDNO.1所示。优选地，所述动物选自兔子，大鼠，羊或牛，免疫量根据动物体重确定。优选地，步骤(2)中，第一次免疫：每只兔子免疫量为HER2抗体蛋白800μg，使用完全弗氏佐剂；第14天后第二次免疫：每只兔子免疫量400μg抗原，使用不完全弗氏佐剂；第29天后第二次免疫：每只兔子免疫量400μg抗原，使用不完全弗氏佐剂优选地，第49天放血收集兔子血清样本。本专利技术第二方面提供一种抗HER2多克隆抗体用于检测HER2抗体的用途。本专利技术的抗Her2多克隆抗体，不仅具有高特异性、高灵敏度，且具有较高的效价，给Her2抗体的检测提供了很好的优质抗体。附图说明下面结合附图及实施例对本专利技术作进一步描述：图1为本专利技术Her2抗原SDS-PAGE图。图2为本专利技术Her2抗原免疫动物血清ELISA检测效价图。图3为本专利技术实施例4的纯化后抗HER2多克隆抗体的效价图。图4为本专利技术抗Her2多克隆抗体SDS-PAGE检测图。图5为本专利技术抗Her2多克隆抗体WesternBlot检测图。具体实施方式为了能够详细了解本专利技术的技术特征及实用功效，并可依照说明书的内容来实施，更进一步以如图式所示的优选实施例，详细说明如后：实施例1免疫原的制备人工合成SeqIDNO.1所示的氨基酸序列的人源重组Her2抗体(我武公司)，将到的Her2抗体，进行SDS-PAGE检测：主要溶液：电泳缓冲液、上样缓冲液、考马斯亮蓝染色液、脱色液。将蛋白溶液加上缓冲液后进行SDS-PAGE电泳浓缩胶：70V30分钟，分离胶：120V90分钟，从左至右上样依次为：泳道1：Maker(ThermoFisher)，泳道2-6:2ugHer2抗体，蛋白纯度99％，实测浓度14.1mg/ml，总量(体积)395μl，MW(实际)100/25KD，MW(理论)150KD。反应结果如图1所示，显示得到较纯的目的抗原。将得到的Her2抗体作为后续试验和实施例中抗原备用。实施例2动物免疫新西兰家兔，单重在2.5-3.5kg之间，免疫前耳缘静脉采血约1ml；第一次免疫：每只兔子免疫800μg抗原，使用完全弗氏佐剂；第一次免疫后第13天耳缘静脉采血0.5ml；第14天后第二次免疫：每只兔子免疫量400μg抗原，使用不完全弗氏佐剂；第二次免疫第28天耳缘静脉采血0.5ml；第二次免疫后第29天：每只兔子免疫量400μg抗原，使用不完全弗氏佐剂；第42天第三次免疫耳缘静脉采血0.5ml；第49天放血收集兔子血清。实施例3血清ELISA检测：1.溶液准备：包被液：15mMNa2CO3，35mMNaHCO3PH＝9.6封闭液：5％脱脂奶粉的PBST血清/抗体稀释液：1％脱脂奶粉的PBST显色液A:醋酸钠柠檬酸30％H2O2显色液B:EDTA-Na柠檬酸甘油TMB(用DMSO溶解10mg/ml)洗涤液：1×PBST终止液：2MH2SO42.实验步骤：1)将Her2抗原按2ug/ml溶解于包被液中；2)在对应的96孔酶标板中加入100μl抗原Her2，4℃过夜；3)次日，倒空液体并拍干残留液体，洗涤液每隔5分钟加入，冲洗三次；4)每孔加入100～150μl封闭液，37℃孵育1h；5)倒空液体并拍干残留液体，洗涤液冲洗三次；6)每孔加入按梯度稀释的一抗100μl，37℃孵育1h；7)倒空液体并拍干残留液体，洗涤液冲洗三次；8)每孔加入按1：10000稀释的二抗，37℃孵育1h；9)倒空液体并拍干残留液体，洗涤液冲洗三到四次；10)拍干孔中残留液体，每孔加入100μl混合的显色液本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种抗HER2的多克隆抗体,所述多克隆抗体通过如下方法制备得到：(1)制备得到HER2抗体，并进行纯化；(2)将前述的HER2抗体作为抗原对动物进行多次免疫，收集动物每次被免疫后的血清样本，(3)将所述各个血清样本进行ELISA效价检测，(4)选择效价大于1:2000K数值的血清样本，进行收集，并进行初步纯化，(5)将初步纯化的血清样本，进一步进行亲和柱层析纯化。

【技术特征摘要】
1.一种抗HER2的多克隆抗体,所述多克隆抗体通过如下方法制备得到：(1)制备得到HER2抗体，并进行纯化；(2)将前述的HER2抗体作为抗原对动物进行多次免疫，收集动物每次被免疫后的血清样本，(3)将所述各个血清样本进行ELISA效价检测，(4)选择效价大于1:2000K数值的血清样本，进行收集，并进行初步纯化，(5)将初步纯化的血清样本，进一步进行亲和柱层析纯化。2.根据权利要求1所述的抗HER2的多克隆抗体，其特征在于，所述HER2抗体作为抗原至少免疫动物两次。3.根据权利要求1所述的抗HER2的多克隆抗体，其特征在于，所述HER2抗体包括鼠源HER2抗体，嵌合HER2抗体，改型HER2抗体，全人源化HER2抗体和表面重塑人源化HER2抗体。4.根据权利要求1...

【专利技术属性】
技术研发人员：张茂祥，章文，裴毓，章登吉，武勇，
申请(专利权)人：四川妙和生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：四川,51