一种以诱惑红为探针的共振瑞利散射法测定壳寡糖含量的方法技术

本发明专利技术涉及一种以诱惑红为探针的共振瑞利散射法测定壳寡糖含量的方法，属于大分子检测领域。本发明专利技术于BR缓冲溶液中，壳寡糖和诱惑红缔合后，散射值明显增大，并在470.5nm处有最大散射峰，且在一定的浓度范围内，其散射值随壳寡糖含量的增加而增大，并且在一定浓度范围内呈线性关系。据此，建立了一种壳寡糖的测定方法，其具有试剂廉价，灵敏度高，重现性好和操作方便等优点，适合在实际应用中推广使用。

A Resonance Rayleigh Scattering Method for the Determination of Chitooligosaccharide Content Using Temptation Red as Probe

The invention relates to a resonance Rayleigh scattering method for the determination of chitosan oligosaccharide content using temptation red as a probe, belonging to the field of macromolecule detection. When the chitosan oligosaccharide and temptation red are combined in BR buffer solution, the scattering value increases obviously, and there is a maximum scattering peak at 470.5 nm. In a certain concentration range, the scattering value increases with the increase of the content of chitosan oligosaccharide, and has a linear relationship in a certain concentration range. A method for the determination of chitosan oligosaccharides was established. The method has the advantages of cheap reagents, high sensitivity, good reproducibility and easy operation. It is suitable for practical application.

【技术实现步骤摘要】
一种以诱惑红为探针的共振瑞利散射法测定壳寡糖含量的方法
本专利技术涉及一种以诱惑红为探针的共振瑞利散射法测定壳寡糖含量的方法，属于大分子检测领域。
技术介绍
壳寡糖(COS)，又称低聚葡糖糖胺，是一种碱性氨基寡糖，由2-氨基葡萄糖通过β-1，4糖苷键连接而成。壳寡糖是壳聚糖的降解产物。分子量在3000以下，聚合度一般在2-20个单糖单位，具有良好的水溶性。壳寡糖还是自然界中唯一存在的含有正电荷的碱性氨基寡糖，绿色天然、无副作用，它作为一类新时代的生理活性物质，除了具有增强免疫、抗肿瘤、降低胆固醇、降血压、降血糖、加速体内钙和铁的吸收以及关节组织的修复等功能外，还具有防腐抑菌、调节人体值等作用，这也是壳寡糖区别于其他寡糖的重要特征，壳寡糖已成为国际上新兴的一种功能性低聚糖，特别是在食品、保健品、医药以及日用化工领域等方面的应用前景引起了国内外学者的普遍关注，但壳寡糖含量的测定方法尚不成熟，因此，一种简便有效测定壳寡糖的方法就显得尤为重要。目前壳寡糖分析研究及测定的方法主要有比色法，色谱法，质谱法，电泳法。最常见的比色法有如邬建敏等通过DNS显色，最终确立了甲壳低聚糖平均聚合度及其平均相对分子质量。刘琳等利用分光光度法测定了壳寡糖平均聚合度，此方法已经能够较为准确地鉴定出壳寡糖的平均聚合度。当然，上述方法因为都是比色法，灵敏度相对其他方法来说并不算高。剩下的色谱法，质谱法，电泳法存在步骤复杂，耗时长、成本相对较高等缺点。而目前在国内外，壳寡糖与诱惑红结合形成离子缔合物用于壳寡糖的分析应用尚未见报道。利用简便、快速、灵敏度高的共振瑞利散射方法直接测定壳寡糖含量的相关研究较少，因此，共振瑞利散射法测定壳寡糖含量有着很大的研究空间及重要意义。共振瑞利散射法(RRS)是近几年发展起来的新的分析技术，作为一种新的分析技术得到越来越多的研究和应用，而本文是通过共振瑞利散射法研究测定壳寡糖含量的简便、快捷、灵敏度更高的新方法，壳寡糖和诱惑红能在一定条件下形成离子缔合物，共振散射强度因此显著增强。再通过共振散射强度与壳寡糖含量在一定的浓度范围内呈线性关系，以此作为壳寡糖的定量基础。
技术实现思路
一种以诱惑红为探针的共振瑞利散射法测定壳寡糖含量的方法，其包括下述步骤：1)绘制壳寡糖的标准曲线在一系列10mL比色管中，按先后顺序分别加入BR缓冲液1.00mL，一定浓度梯度的壳寡糖标准液(20.00μg/mL)(0.50、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00mL)，1mL浓度为1.0×10-4mol/L诱惑红，以蒸馏水定容后充分摇匀。同时以试剂空白作参比，在470.5nm处测RRS，以ΔI-c作线性趋势图得标准曲线。2)20μg/mL的样品工作液的制备：称取一定量待检测样品的胶囊壳，使用冰醋酸溶解并将其定容得到样品储备液，用漏斗脱脂棉过滤储备液，滤液经6000r/min，离心机离心20min，取上清液2.5mL于100mL容量瓶，定容，得浓度为20.00μg/mL的样品工作液。3)样品中壳寡糖含量确定：取样品工作液2mL，按步骤1)检测方法进行测定，在470.5nm处测定其RRS，并计算ΔI＝I-I0，将ΔI代入线性回归方程求得样品中壳寡糖的含量，同时做加标回收试验。如上所述的一种以诱惑红为探针的共振瑞利散射法测定壳寡糖含量的方法，其特征在于，所述的BR缓冲液的pH为4.0，且葡萄糖、甘氨酸、维生素C、柠檬酸等对实验测定结果干扰较小。如上所述的一种以诱惑红为探针的共振瑞利散射法测定壳寡糖含量的方法，其特征在于，步骤1中溶液的加入顺序为首先加入BR缓冲液，其次加入壳寡糖标准液，再次加入诱惑红溶液。如上所述的一种以诱惑红为探针的共振瑞利散射法测定壳寡糖含量的方法，其特征在于，反应后测定的时间为10min-30min。如上所述的一种以诱惑红为探针的共振瑞利散射法测定壳寡糖含量的方法，其特征在于，步骤1)标准曲线中壳寡糖的浓度范围1.00～12.00μg/mL。样品前处理：取待检测胶囊壳，称取一定量胶囊，使用冰醋酸溶解定容得到样品储备液，用漏斗脱脂棉过滤储备液，滤液经6000r/min，离心机离心20min，取上清液2.5mL于100mL容量瓶，定容，得浓度为20μg/mL的样品工作液。样品测定：用样品工作液按实验方法绘制样品曲线，与壳寡糖标准曲线比较，结果为样品的线性回归方程是△I＝167.56c+60.398，相关系数0.9949，结果与标准的壳寡糖标准曲线接近，采用壳寡糖的标准曲线作为定量标准曲线。取样品工作液2mL，按实验方法进行测定，在470.5nm处测定其RRS，并计算ΔI＝I-I0，将ΔI代入线性回归方程求得样品中壳寡糖的含量，同时做加标回收试验。试验例：一、共振瑞利散射法光谱图图1为壳寡糖-诱惑红的共振瑞利散射光谱图，由1到6壳寡糖浓度依次增大。由图1可知，壳寡糖、诱惑红本身的散射值非常低，当壳寡糖与诱惑红结合形成离子缔合物后散射值明显增大，并在470.5nm处有最大散射峰。实验的空白组散射值较低，且实验组随着壳寡糖的浓度的增大，其体系的散射值亦增大，存在线性关系。二、共振瑞利散射法条件优化1.缓冲体系及pH本研究分别考察了柠檬酸-柠檬酸钠、磷酸氢二钠-柠檬酸、BR、甘氨酸-盐酸四种缓冲溶液对体系RRS的影响。结果表明，诱惑红与壳寡糖的反应在BR缓冲溶液中ΔIRRs较大且稳定。改变BR缓冲体系的酸度范围pH3.0、4.0、5.0、6.0，测定相应pH值的RRS值。绘制ΔI-pH曲线。结果如图2显示，pH4.0时ΔI最大，故选择体系反应pH＝4.02.缓冲溶液加入量的影响缓冲溶液为实验体系提供合适的酸度结合环境，其加入量对离子缔合物的形成有着一定的影响，不改变其他实验条件，改变pH＝4.0的BR缓冲溶液的加入量为1.0、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0mL，测定其相应的RRS。结果表明，随缓冲溶液加入量的增大，RRS值呈下降趋势，故选择BR缓冲液的用量是1.00mL。3.诱惑红加入量的影响不改变其他实验条件，改变浓度为1.0×10-4mol/L的诱惑红的加入量为0.5，1.0，1.5，2.0mL，测定其吸光度值。如图4结果所示，诱惑红加入量为1ml时ΔIRRs强度达到最大，用量过多或过少均会导致ΔIRRS值降低。显然，诱惑红用量过少，反应会进行得不完全；用量过多则会影响诱惑红与壳寡糖的离子缔合作用，从而导致RRS强度降低。4.增敏剂的筛选某些表面活性剂能起到一定增敏作用，故本试验考察了十二烷基硫酸钠(SDS)，吐温20，吐温80，聚乙烯醇，OP-10对体系RRS的影响。结果表明，所选用的五种增敏剂均没有增敏作用，故后续实验暂不探讨增敏剂对实验的影响。5.反应温度的影响在实验条件下，考察了20～100℃不同温度对体系的影响。结果表明，温度对该反应影响较大，一定条件下，在室温时反应效果最好，故实验选择控制在室温下进行。6.稳定时间的影响在较优实验条件下，考察体系的稳定时间，考察时间130min。室温下反应后，测定放置10，20，30，50，70，90，110，130min后体系的测其吸光度值ΔI。以ΔI-t作图，结果表明(见图7)，反应在10min-30min内保持相对稳定，30min后Δ本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种以诱惑红为探针的共振瑞利散射法测定壳寡糖含量的方法，其包括下述步骤：1)绘制壳寡糖的标准曲线在一系列10mL比色管中，按先后顺序分别加入BR缓冲液1.00mL，一定浓度梯度的壳寡糖标准液，1mL浓度为1.0×10‑4mol/L诱惑红，以蒸馏水定容后充分摇匀；同时以试剂空白作参比，在470.5nm处测RRS，以ΔI‑c作线性趋势图得标准曲线；2)20μg/mL的样品工作液的制备：称取一定量待检测样品的胶囊壳，使用冰醋酸溶解并将其定容得到样品储备液，用漏斗脱脂棉过滤储备液，滤液经6000r/min，离心机离心20min，取上清液2.5mL于100mL容量瓶，定容，得浓度为20.00μg/mL的样品工作液；3)样品中壳寡糖含量确定：取样品工作液2mL，按步骤1)检测方法进行测定，在470.5nm处测定其RRS，并计算ΔI＝I‑I0，将ΔI代入线性回归方程求得样品中壳寡糖的含量，同时做加标回收试验。

【技术特征摘要】
1.一种以诱惑红为探针的共振瑞利散射法测定壳寡糖含量的方法，其包括下述步骤：1)绘制壳寡糖的标准曲线在一系列10mL比色管中，按先后顺序分别加入BR缓冲液1.00mL，一定浓度梯度的壳寡糖标准液，1mL浓度为1.0×10-4mol/L诱惑红，以蒸馏水定容后充分摇匀；同时以试剂空白作参比，在470.5nm处测RRS，以ΔI-c作线性趋势图得标准曲线；2)20μg/mL的样品工作液的制备：称取一定量待检测样品的胶囊壳，使用冰醋酸溶解并将其定容得到样品储备液，用漏斗脱脂棉过滤储备液，滤液经6000r/min，离心机离心20min，取上清液2.5mL于100mL容量瓶，定容，得浓度为20.00μg/mL的样品工作液；3)样品中壳寡糖含量确定：取样品工作液2mL，按步骤1)检测方法进行测定，在470.5...

【专利技术属性】
技术研发人员：白研，苏政权，毋福海，张艳林，
申请(专利权)人：广东药科大学，
类型：发明
国别省市：广东,44