一种中性粒细胞胞外诱捕网的诱导物及其快速诱导方法技术

本发明专利技术提供了一种在体外快速诱导中性粒细胞产生胞外诱捕网的诱导物及诱导方法，其中诱导物包含以下组分：预处理组分A，选自IgG2、IgG4；诱导组分B，选自APD或APD与PMA组成的混合物；脂多糖。同时，本发明专利技术还提供了一种在体外快速诱导中性粒细胞产生胞外诱捕网(NETs)的诱导方法，包括以下步骤：分离外周血中性粒细胞；利用上述包含组分A、组分B和脂多糖的诱导物诱导中性粒细胞，以形成NETs。本发明专利技术诱导物和诱导方法在哺乳动物NETs快速检测以及促进或抑制NETs生成药物的筛选方面具有良好的应用前景。

An Inducer of Neutrophil Extracellular Trap Net and Its Rapid Induction Method

The invention provides an inducer and an induction method for rapidly inducing neutrophils to produce extracellular trap nets in vitro. The inducer comprises the following components: pretreatment component A, selected from IgG2 and IgG4; induction component B, selected from a mixture of APD or APD and PMA; and lipopolysaccharide. At the same time, the invention also provides an induction method for rapidly inducing neutrophils to produce extracellular trap nets (NETs) in vitro, including the following steps: isolating peripheral blood neutrophils; inducing neutrophils to form NETs by using the inducers containing component A, component B and lipopolysaccharide. The inductor and the inducing method of the invention have good application prospects in the rapid detection of mammalian NETs and the screening of drugs that promote or inhibit the formation of NETs.

【技术实现步骤摘要】
一种中性粒细胞胞外诱捕网的诱导物及其快速诱导方法
本专利技术提供了一种诱导中性粒细胞产生胞外诱捕网(NETs)的诱导物及诱导方法，具体而言，提供了一种用于快速检测的在体外快速诱导中性粒细胞产生胞外诱捕网的复合诱导物及诱导方法，属于生物检测和医学检测领域。
技术介绍
中性粒细胞是天然免疫系统中重要的效应细胞，也是血浆中丰度最高的白细胞。中性粒细胞具有独特的分叶型核结构，通常呈3~5个叶，因此，也称多形核嗜中性粒细胞（polymorphonuclearneutrophil，PMN）。生理情况下，中性粒细胞占人外周血白细胞的50%~70%。它是针对病原体侵袭产生的应答首先募集至损伤部位的细胞，并且是先天性免疫防御的第一道防线。感染发生时，其最先被募集到感染部位，发挥清除病原微生物的作用。传统上将中性粒细胞认为是炎性应答和急性免疫的效应细胞，其通过胞内吞噬作用发挥功能，并且使用裂解蛋白酶、活性氧(ROS)和杀微生物蛋白用于攻击感染剂。现有技术表明，中性粒细胞还能够通过表达用于与其他免疫细胞，如树突状细胞、B细胞和T细胞传递信号的细胞因子、趋化因子、Fc受体和补体成分具有免疫调节能力(Mantovani,Cassatella等，2011)。近年研究还表明，除了吞噬之外，中性粒细胞还能通过释放中性粒细胞胞外诱捕网（neutrophilextracellulartrap，NETs）的方式黏附并清除病原微生物，并能有效限制病原体向其他组织部位播散。NETs是一种细胞外结构，因细菌感染而引起中性粒细胞被激活，分叶核的形态、染色质的分布变得不清晰，然后核膜消失，染色质结构中混合有细胞质、颗粒成分，细胞膜破裂，此时，所述中性粒细胞胞外诱捕网释放网状结构，捕获细菌、真菌、寄生虫、病毒，发挥抗菌作用。NETs主要由组蛋白、DNA和弹性蛋白酶、组织蛋白酶G和髓过氧化物酶（MPO）等酶类组成。具体地说，NETs是由中性粒细胞受到刺激活化后释放到胞外的一种网状结构，以DNA为骨架，其间镶嵌有组蛋白、髓过氧化物酶（MPO）、中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）、组织蛋白酶G、钙网蛋白、蛋白酶3等具有杀菌和增加通透性作用的蛋白，这些蛋白镶嵌在DNA骨架上大大增加了其局部浓度。NETs主要依靠其独特的三维网状结构捕获病原体，并依靠包含的大量抗菌蛋白对病原体进行杀灭，同时NETs对病原体的捕捉固定可以增强其他白细胞的吞噬作用。NETs可以捕杀多种病原体，包括革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌、真菌、伯氏包柔螺旋体及某些寄生虫等，甚至包括人类免疫缺陷病毒（HIV），HIV可通过TLR-1及TLR-8刺激NETs生成然后通过MPO和α-防御素清除HIV。但某些病原体如肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌等可通过产生DNase破坏NETs的DNA骨架从而逃避捕杀。由于产生NETs，导致中性粒细胞死亡(NETosis)，若中性粒细胞被LPS、PMA刺激，则产生自噬，同时，生成活性氧。由此，产生核膜破裂、染色质解凝缩、组蛋白瓜氨酸化，引起细胞死亡。另外，现有技术报告了随着NETs的形成，中性粒细胞通过脱颗粒分泌大量蛋白质，特别是嗜苯胺蓝颗粒，也分泌与细胞结构相关的蛋白质等(QRemijsen等，2011，CellDeathandDifferentiation，18：581-588)。这些蛋白质也被称为NETs结构蛋白质。NETs本来的作用是捕捉外来微生物并限制在局部，进行杀菌。但进一步的研究表明，随着感染病等转为慢性，即使在不存在外来微生物的情况下也观察到NETs的形成。例如自身免疫性疾病之一的系统性红斑狼疮(SLE)形成了针对自身DNA、相关蛋白质的自身抗体。SLE显示在损伤部位存在大量中性粒细胞。SLE患者的中性粒细胞比健康人的中性粒细胞更容易引起NETosis。考虑到病情的改善，往往需要抑制NETs形成的情况。抑制NETs形成的物质，包括针对组蛋白的抗体、抑制超氧化物产生的物质，例如二亚苯基烟碱氯化物(DiphenyleneIodoniumChloride，DPI)、过氧化氢酶等(TobiasA.Fuchs等，2007，JCellBiol，176：231-241)。髓过氧化物酶(Myeloperoxidase，MPO)活性也影响NETosis(K.Akong-Moore等，2012，PLOSONE，7：e42984)。此外，现有技术还公开了抑制NETs的一系列物质，例如以下几个专利。日本特开JP2008-189637公开了来自乳的碱性蛋白质组分为有效成分抑制NETs，并预防I型糖尿病、类风湿关节炎的自身免疫性疾病。WO2014/168253公开了治疗因NETs的形成而导致的疾病的药剂，具体地，提供一种抑制白细胞的细胞外诱捕网形成的新型的药剂。其含有乳铁蛋白的白细胞的细胞外诱捕网形成抑制剂和用于治疗含有乳铁蛋白的白细胞的细胞外诱捕网形成相关的疾病的组合物。专利WO2016/056665公开了一种包含乳铁蛋白片段的白细胞的细胞外诱捕网形成抑制剂、以及包含乳铁蛋白的用于治疗与白细胞的细胞外诱捕网形成相关的疾病的组合物，其包含作为有效成分的含有由X1-K-C-X2-X3-X4-Q-X5-X6-X7-X8-X9表示的氨基酸序列的肽。在NETs检测及其抑制剂的药物筛选中，均需要使用诱导物在体外诱导中性粒细胞。相比抑制剂，对于NETs的诱导物则种类较多，除微生物外，脂多糖（LPS）、（12-）十四酸佛波酯（-13-）乙酸盐(PMA，又称佛波醇酯)、活化的血小板等均能在一定程度上刺激中性粒细胞产生NETs。另外，某些细胞因子如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-8（IL-8）、干扰素（INF）等也可在一定程度上刺激和促进NETs的生成。现有技术已经报道了采用高浓度PMA作为诱导剂，并加入sytoxgreen，使用共聚焦显微镜检测NETs形成情况。由于PMA诱导中性粒细胞产生NETs，加入ROS探针，也可通过共聚焦检测绿色荧光分布。但是，现有的NETs体外诱导、检测方法中，所使用的上述诱导物要么价格昂贵、获取不易(例如白细胞介素、肿瘤坏死因子等)，要么具有强烈致癌性(例如PMA)，或者需高浓度才具有良好诱导能力(例如LPS)。更重要的是，上述诱导物存在的缺陷除了除了需要高浓度之外，现有的诱导物在通过宿主模式识别受体并诱导NETs释放能力方面具有低的效率，诱导刺激时间往往需要高达几个小时以上；不能够快速诱导NETs释放，严重影响了诱导效率。例如，现有技术体外实验中，通常采用PMA作为NETs的诱导剂。但是，较低的PMA使用浓度(例如低于40nM)诱导效果极差甚至不具备诱导效应，这种诱导效果差的效应与诱导时间时间长短几乎无关，也就是说，延长诱导时间几乎不能提高诱导效果；更糟的是，即使使用较高的诱导浓度(例如高于50nM)，也需要较长的刺激时间，通常需要四五个小时以上才能产生显著的NETs。另外，采用包括PMA在内的现有其他诱导物直接诱导细胞的另一缺陷是，即使使用高浓度(例如100nM以上的PMA)诱导，也不会在短时间内形成NETs，只有在高浓度和足够诱导时间(例如大于2-3h)二者兼备的情况下才能产生显著性的NETs，方可用于检测。因此，尽管PMA等诱导物因其在体外诱导本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种在体外快速诱导中性粒细胞产生胞外诱捕网NETs的诱导物，其特征在于，包含以下组分：预处理组分A，选自IgG2、IgG4中的一种或两种；诱导组分B，选自APD(12‑O‑乙酰佛波醇‑13‑癸酰酯)或APD与PMA组成的混合物；脂多糖。

【技术特征摘要】
1.一种在体外快速诱导中性粒细胞产生胞外诱捕网NETs的诱导物，其特征在于，包含以下组分：预处理组分A，选自IgG2、IgG4中的一种或两种；诱导组分B，选自APD(12-O-乙酰佛波醇-13-癸酰酯)或APD与PMA组成的混合物；脂多糖。2.一种在体外快速诱导中性粒细胞产生胞外诱捕网NETs的诱导方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)分离外周血中性粒细胞；(2)利用包含组分A、组分B和脂多糖的诱导物诱导中性粒细胞，从而形成NETs；其中，组分A、组分B定义与权利要求1中所述定义相同。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，其进一步包括NETs鉴定与定量分析的后处理步骤。4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中的诱导为分阶段诱导，包括预处理、快速诱导、延伸诱导三个阶段。5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述组分A中IgG的诱导终浓度为1-20nM；APD的诱导终浓度为5-20nM；PMA诱导终浓度为不高于20nM；脂多糖诱导终浓度为10-50nM。6.如权利要求2-5所述的方法，其特征在于，步骤(1)具体过程如下：(a)取抗凝外周静脉血5-10ml，与PBS按照1：1的比例稀释；(b)在离心管中加入10-20ml分离液，然后将稀释的抗凝血缓慢沿管壁徐徐滴流加入到分离液上层；(c)在室温条件下700-900×g水平离心30-40min；离心后呈现不同的分层，用毛细管伸至白细胞层中，沿管壁吸出全部白细胞至一新EP管；(d)用1-2mlPBS洗涤白细胞，1500-2500rpm离心10-15min，留取沉淀，重复1-2次；(e)用含5%FBS的RPMI培养基重悬细胞，3-4g/L台盼蓝染色，计数板分类计数并鉴定细胞纯度；纯度较低时，重复步骤(d)。7.如权利要求2-5所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)体外诱导中性粒细胞形成NETs的具体过程如下：(1...

【专利技术属性】
技术研发人员：张海英，
申请(专利权)人：张海英，
类型：发明
国别省市：浙江,33