源于草酸青霉的4-4’异构化黑麦酮酸D在淋巴瘤方面的应用制造技术

本发明专利技术涉及一种源于草酸青霉的4‑4’异构化黑麦酮酸D在淋巴瘤方面的应用。该化合物结构特征是：与已知物黑麦酮酸D的2‑2’连接不同，异构化为罕见的4‑4’连接。经实验证实，所述多酚类化合物对淋巴瘤细胞具有较好的抑制活性。可作为制备淋巴瘤细胞增殖抑制药物或抗淋巴瘤药物用于抗肿瘤的研究。

Application of 4-4'isomerized ryeglutonic acid D from Penicillium oxalate in lymphoma

The present invention relates to the application of 4 4'isomerized ryeglutonic acid D derived from Penicillium oxalate in lymphoma. The structure of the compound is characterized by its isomerization into a rare 4 4 connection, which is different from the 2 2 linkage of ryeglutonic acid D. Experiments have proved that the polyphenols have good inhibitory activity on lymphoma cells. It can be used to prepare lymphoma cell proliferation inhibitors or anti-lymphoma drugs for anti-tumor research.

【技术实现步骤摘要】
源于草酸青霉的4-4’异构化黑麦酮酸D在淋巴瘤方面的应用
本专利技术涉及一种源于草酸青霉的4-4’异构化黑麦酮酸D在淋巴瘤方面的应用。
技术介绍
黑麦酮酸是一类由微生物次级代谢产生的多酚类有机化合物，自1952年黑麦酮酸A首次从真菌中发现至今，已经过去了半个多世纪。该类化合物发现至今，一共报道了9个，分别是黑麦酮酸A-I。除了黑麦酮酸I，所有天然来源的黑麦酮酸均为2-2’连接。黑麦酮酸I则是4-2’连接，4-4’连接非常罕见。该类化合物对肿瘤细胞抑制明显，是开发抗肿瘤药物或者肿瘤细胞增殖抑制剂的理想原料。本专利技术人研究得知，草酸青霉(Penicilliumoxalicum)IBPT-6，(已于2013年12月25日保藏在中国典型培养物保藏中心，地址:武汉武汉大学，保藏编号是：CCTCCNO：M2013714)的发酵产物的粗提取物有很好的细胞增殖抑制活性，遂对其活性成分进行研究。研究发现所示黑麦酮酸类化合物具有抗人淋巴瘤活性，目前尚未见该化合物对人淋巴瘤细胞的增殖抑制活性的报道，因此市场上也尚未见有与此相关的药物。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种源于草酸青霉的4-4’异构化黑麦酮酸D在淋巴瘤方面的应用。该化合物具有抑制淋巴瘤细胞增殖作用，具有抗人淋巴瘤活性。其结构式为：。该化合物的制备方法，是通过发酵培养草酸青霉(Penicilliumoxalicum)IBPT-6，获取发酵物，然后从发酵物中分离纯化出该化合物。具体步骤如下：1发酵生产培养微生物的常规方法，取草酸青霉(Penicilliumoxalicum)IBPT-6接种到PDA固体斜面培养基上在28℃培养箱中培养2至3天，然后接种到培养液中，28℃静止培养30天后，获得菌丝体和发酵液；所述培养液组成：每升水含甘露醇20.0g、酵母膏3.0g、麦芽糖20.0g、味精10.0g、葡萄糖10.0g、KH2PO40.5g、MgSO4·7H2O0.3g、NaCl15.0g；2浸膏的获得用纱布将菌丝体和发酵液分离。菌丝体用丙酮溶液（含20%~30%水）连续超声破壁3次，过滤去除残渣，得到菌丝体的含丙酮和水的粗提物。减压浓缩去除丙酮，得到粗体物的水溶液，再以体积比1:2加入乙酸乙酯萃取3次，得乙酸乙酯粗提液，减压浓缩至近干得菌丝体浸膏36.5g。3化合物的分离精制菌丝体浸膏通过100-200目硅胶拌样，以石油醚：二氯甲烷：甲醇为梯度洗脱液，进行减压硅胶色谱柱层析。经过简单的薄层色谱分析，合并，分离成组分A-E。组分C(12.7g)(二氯甲烷洗脱物)以二氯甲烷：甲醇=1:2为梯度洗脱剂，进行凝胶柱层析（SephadexLH-20），经过薄层色谱分析后合并得到四个亚组分C-1~C-4。亚组分C-3(4.9g)通过半制备液相色谱(1010型ODS-A，10×250mm，5μm)：分离流速为5mL/min，流动相为55%乙腈含0.1%TFA，得到所示化合物(1.1g，tR18.5min)。所述草酸青霉(Penicilliumoxalicum)IBPT-6，已于2013年12月25日保藏在中国典型培养物保藏中心，地址:武汉武汉大学，保藏编号是：CCTCCNO：M2013714。本专利技术还保护了所述的化合物在制备抑制人淋巴瘤细胞增殖药物中的用途，及该化合物在制备抗人淋巴瘤药物中的用途。本专利技术的显著优点：研究所示该黑麦酮酸化合物具有显著的抑制人淋巴瘤细胞增殖活性，目前尚未见该化合物对人淋巴瘤细胞增殖抑制活性的报道，因此市场上也尚未见有与此相关的药物。附图说明图1为4-4’异构化黑麦酮酸D主要的COSY，HMBC和NOE信号。具体实施方式在如下的实施例中所指的化合物的化学结构：实施例1该化合物的发酵生产及分离精制1发酵生产生产菌的发酵培养：按培养微生物的常规方法，取草酸青霉(Penicilliumoxalicum)IBPT-6(已于2013年12月25日保藏在中国典型培养物保藏中心，地址:武汉武汉大学，保藏编号是：CCTCCNO：M2013714)适量，接种到PDA固体斜面培养基上在28℃培养箱中培养2至3天。取斜面培养2至3天的草酸青霉(Penicilliumoxalicum)IBPT-6适量，接种到装有400mL培养液[培养液组成(克/升)：甘露醇20.0，酵母膏3.0，麦芽糖20.0，味精10.0，葡萄糖10.0，KH2PO40.5，MgSO4·7H2O0.3，NaCl15.0定容]的1000mL锥形瓶中，28℃静止培养30天后，获得菌丝体和发酵液。2浸膏的获得用纱布将菌丝体和发酵液分离。菌丝体用丙酮溶液（含20%~30%水）连续超声破壁3次，过滤去除残渣，得到菌丝体的含丙酮和水的粗提物。减压浓缩去除丙酮，得到粗体物的水溶液，再以体积比1:2加入乙酸乙酯萃取3次，得乙酸乙酯粗提液，减压浓缩至近干得菌丝体浸膏36.5g。3化合物的分离精制菌丝体浸膏通过100-200目硅胶拌样，以石油醚：二氯甲烷：甲醇为梯度洗脱液，进行减压硅胶色谱柱层析。经过简单的薄层色谱分析，合并，分离成组分A-E。组分C(12.7g)(二氯甲烷洗脱物)以二氯甲烷：甲醇=1:2为梯度洗脱剂，进行凝胶柱层析（SephadexLH-20），经过薄层色谱分析后合并得到四个亚组分C-1~C-4。亚组分C-3(4.9g)通过半制备液相色谱(1010型ODS-A，10×250mm，5μm)：分离流速为5mL/min，流动相为55%乙腈含0.1%TFA，得到所示化合物(1.1g，tR18.5min)。化合物常温下为黄色粉末，高分辨电喷雾质谱HRESI-MS在m/z：661.1531处给出分子离子峰[M+Na]+（calcdforC32H30NaO14,661.1533）；提示分子量为638，结合波谱信息推测分子式为C32H30O14。1H和13C-NMR数据见表1，主要的COSY，HMBC和NOE信号见图1。表1化合物的1H和13C-NMR数据(500MHz1Hand126MHz13C,inDMSO-d6)实施例2体外抗肿瘤活性的测试1实验样品及实验方法被测样品溶液的配制：测试样品为上述实施1中分离精制的化合物纯品。精密称取适量样品，用DMSO配制成所需浓度的溶液，供测活性。从-80°C超低温冰箱或者液氮中取出冻存的细胞株，在37°C水浴锅中迅速溶化，1000rpm离心5min，超净台中吸去冻存液，加入1mL培养基吹打后吸入培养瓶中，加入10毫升新鲜DMEM或RPMI1640培养基，轻轻摇动使细胞在培养基中均匀悬浮，置37°C、5%CO2的培养箱中培养。当细胞长满需要传代时，先弃去瓶内的旧培养基，再用PBS冲洗2遍，加入300μL胰酶（确保胰酶能覆盖瓶底），在37°C培养箱中消化至细胞变圆即将脱落时，加入含10%胎牛血清的培养基终止消化，吹打混匀后分至2至3个新的培养瓶中，补充培养基使细胞在培养箱中继续生长。细胞增殖抑制活性测试方法（WST-1法）抗肿瘤细胞活性评价采用WST-1试剂盒检测法，取对数生长期的肿瘤细胞消化后制成细胞浓度为3×104/mL的单细胞悬液，将细胞悬液混匀后取100μL接种于96孔板中，为确保每孔的细胞数目一致，每加5个复孔，就将细胞悬液混匀一次。然后置于37°C、5%CO2培养箱内培养本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种源于草酸青霉的4‑4’异构化黑麦酮酸D的应用，其特征在于，所述的4‑4’异构化黑麦酮酸D的结构式为

【技术特征摘要】
1.一种源于草酸青霉的4-4’异构化黑麦酮酸D的应用，其特征在于，所述的4-4’异构化黑麦酮酸D的结构式为，所述的4-4’异构化黑麦酮酸D在制备淋巴瘤细胞增殖抑制药物中的...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈立，程苗苗，刘沁颖，伍久林，鲁志浩，李亚平，张其清，
申请(专利权)人：福州大学，
类型：发明
国别省市：福建,35