本发明专利技术公开了一种基于银染增强的纳米金技术检测核酸的方法。首先通过设计指示探针RP和捕获探针CP分别与目标物DNA‑7a两端互补，磁珠标记捕获探针形成MB‑CP结构，金纳米标记识别探针形成Au‑RP结构。在目标物核酸的存在情况下，磁珠上修饰的捕获探针以及金纳米修饰的识别探针分别与目标物的两端完全互补，形成“三明治”复合物结构，利用金纳米良好的催化作用，用银染增强的方式实现信号的放大，经磁性分离，硝酸消解沉积在金纳米上面的银后，再通过差分脉冲溶出伏安法检测其信号，从而定量检测目标物。该方法选择性好、灵敏度高、仪器简单，在遗传疾病的临床诊断中有着重大的实际意义和应用价值。
【技术实现步骤摘要】
一种基于银染增强的纳米金技术检测核酸的方法
本专利技术涉及一种基于银染增强的纳米金技术检测核酸的方法，属于分子生物学和核酸化学领域。
技术介绍
现知的人类疾病都与基因有着直接或间接的关系,核酸的检测和分析在遗传性疾病、传染病和肿瘤等领域的应用日益广泛，所以建立一种高灵敏度、高选择性和特异性的检测方法具有十分重要的意义。以往的方法大多建立在标记放射性元素、荧光以及电化学发光物质的探针与目标物序列的杂交的体系上。但由于其试剂价格昂贵，且需要的实验环境以及设备要求高等方面加大限制了其应用。所以建立一种高灵敏度、高选择性的检测方法极其必要。随着纳米技术的发展，纳米金的应用得到了广泛的关注。金纳米粒子（AuNPs）有着其独特的物理和化学性质，如极高的消光系数、稳定的化学性质、优异的荧光淬灭能力以及显著的催化作用，使其成为了纳米科学研究中不可分割的一部分，纳米金作为标记物，广泛应用于蛋白质、癌症标记物、免疫球蛋白以及寡核苷酸的检测。硫醇化的DNA修饰AuNPs的在生物分析、诊断方面更是受到广泛的重视，DNA-AuNPs结构稳定，更是具有优秀的单碱基错配特异性识别能力。同时，由于金纳米良好的催化功能，使用银染的方式沉积银进行信号的扩大取得了不错的结果，在遗传疾病的临床诊断中起到了重大的实际意义和应用价值。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种基于银染增强的纳米金技术检测核酸的方法。具体步骤为：（1）纳米金合成制备：移取100mL质量百分比浓度为0.01%的氯金酸溶液倒入圆底烧瓶中，将其放置油浴锅中加热煮沸后迅速加入3mL质量百分比浓度为1%的柠檬酸钠溶液作为还原剂，继续加热15分钟，观察溶液的颜色从最初的淡黄色逐渐变成酒红色，最后停止加热冷却至室温，并且全程处于搅拌状态下进行。通过扫描电子显微镜表征可知纳米金的粒径为16nm。（2）金标记识别探针（Au-RP）的制备：移取60μL浓度为10μmol/L巯基修饰的DNA识别探针（RP）加入60μL含10mmol/L三(2-羧乙基)膦（TCEP）浓度为10mmol/LpH5.8的磷酸盐缓冲溶液（PBS）中活化2小时，活化完毕后加入1mL步骤（1）合成的浓度为5.8nmol/mL金纳米溶液，立即震荡均匀并迅速裹上锡纸避光孵育16小时；接着分别往里加入11.3μL质量百分比浓度为10%的十二烷基硫酸钠（SDS）溶液，使最终质量百分比浓度为0.1%，加入125.7μL浓度为0.1mol/LpH7.4PBS溶液，使其最终浓度为10mmol/L，再加入66.16μL浓度为2mol/L的NaCl，使其最终浓度为0.1mol/L。在孵育24小时后使用高速离心机离心（10000转/分钟，20分钟），分散至含0.1mol/LNaCl浓度为10mmol/LpH7.4PBS缓冲溶液中并重复清洗3次，去掉上清液，最后分散至含1mL含0.1mol/LNaCl浓度为10mmol/LpH7.4PBS溶液中，震荡均匀，放置在4℃的黑暗环境中储存备用。（3）磁珠标记捕获探针（MB-CP）的制备：量取1mg磁珠置于离心管中，经过磁性分离，弃去上清液，然后用100μLTTL缓冲溶液（100mmol/LTris-HCl；pH8.0，体积百分比浓度为的0.1%Tween®20；1mol/LLiCl）溶液清洗1次，接着分散至200μLTTL缓冲溶液中，然后往溶液中加入50μL浓度为10μmol/L生物素修饰的DNA（CP），在室温下轻微震荡孵育15分钟，以使生物素修饰的探针与链霉亲和素包被的磁珠轻缓而充分地结合，最后使用100μLTT缓冲溶液（250mmol/LTris-HCl；pH8.0，体积百分比浓度为0.1%的Tween®20）清洗2次，磁性分离，弃去上清液，分散至500μL含0.2mol/LNaCl浓度为10mmol/LpH7.4PBS溶液中储存备用。（4）探针杂交反应：移取10μL步骤（3）中浓度为10mg/mL的捕获探针（MB-CP）、10μL浓度范围为50fmol/L~250pmol/L的目标物和30μL含0.1mol/LNaCl浓度为10mmol/LpH7.4PBS放进0.2mL离心管，震荡混匀后置于PCR仪中30℃加热30分钟，取出溶液进行磁性分离，用含0.1mol/LNaCl浓度为10mmol/LpH7.4PBS清洗2次后，分散在50μL含0.1mol/LNaCl浓度为10mmol/LpH7.4PBS溶液中，随后往溶液中加入10μL步骤（2）中浓度为5.8nmol/mL识别探针（Au-RP），震荡混匀后置于PCR仪中在30℃下孵育45分钟，磁性分离，分别用100μL含0.1mol/LNaCl浓度为10mmol/LpH7.4PBS、含0.1mol/LNaNO310mmol/LpH7.4PBS以及0.1mol/LNaNO3进行清洗，去除游离的纳米金探针。（5）银染和电化学分析检测：银增强剂溶液通过混合三种溶液制备，首先制备浓度为15mmol/LAgNO3（溶液A），浓度为50mmol/L对苯二酚（溶液B）以及浓度为150mmol/L柠檬酸和浓度为50mmol/L柠檬酸三钠（溶液C），使用前的体积比为1：1：1，溶液B和溶液C在银染之前的半个小时左右开始在水浴锅中保持30℃温育。在清洗后的产物中加入银染溶液并快速震荡混匀且放置在光线暗淡的环境中反应12分钟（3分钟/次），反应完毕后立即加入50μL浓度为0.3mol/L的Na2S2O3溶液终止反应，避免产生非特异性的沉淀。磁性分离去除上清液，加入去离子水清洗3~5次后加入100μL体积百分比浓度为50%的HNO3消解30分钟；消解完毕后将溶液全部移至1.9mL浓度为0.1mol/LHNO3/KNO3溶液中，应用处理好的玻碳电极在-0.5V搅拌富集5分钟，静置30秒，利用时差脉冲溶出伏安法在0V~0.7V范围内扫描，记录电化学响应。峰电流信号与不同目标物浓度成正相关，通过一系列实验条件优化，确定杂交时间60分钟，银染的时间12分钟（3分钟/次），沉积时间300秒，沉积电位-0.5V为最优实验条件，还原峰电流与目标物浓度的对数有着良好的线性关系（Y=1.2632X+11.6395，R=0.9911)，检测范围为50fmol/L~250pmol/L，检出限为17fmol/L。（6）方法特异性：在最优的实验条件下，分别取10µLx相同浓度的错配序列DNA-7a、DNA-7b、DNA-7c、DNA-7d、DNA-7e、DNA-7g按照以上实验原理进行杂交、银染和检测。本专利技术方法的优点如下：首先，该方法灵敏度高，利用金纳米良好的催化性质，加入银染试剂沉积银使其放大信号，检出限可到17fmol/L；具有较高的选择性和特异性，能够很好地区分互补目标与单碱基错配和非互补序列；分析步骤简便且时间较短，磁珠材料的应用更是为分离步骤节约时间；结合电化学检测方法，分析速度快、灵敏高且易于实现自动化。附图说明图1为本专利技术银染增强的纳米金技术检测核酸的原理图。图2为本专利技术实施例纳米金的扫描电镜图（A）和粒径分布图（B）。图3为本专利技术实施例金纳米（a）和金纳米标记探针（b）紫外可见吸收光谱图。图4为本专利技术实施例杂交时间优化图。图5为本专利技术实施例银染时间优化图。图6为本专利技术实施本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基于银染增强的纳米金技术检测核酸的方法，其特征在于具体步骤为：（1）纳米金合成制备：移取100 mL质量百分比浓度为0.01%的氯金酸溶液倒入圆底烧瓶中，将其放置油浴锅中加热煮沸后迅速加入3 mL 质量百分比浓度为1%的柠檬酸钠溶液作为还原剂，继续加热15分钟，观察溶液的颜色从最初的淡黄色逐渐变成酒红色，最后停止加热冷却至室温，并且全程处于搅拌状态下进行；通过扫描电子显微镜表征可知纳米金的粒径为16nm；（2）金标记识别探针Au‑RP的制备：移取60 μL 浓度为10 μmol/L巯基修饰的DNA识别探针RP加入60 μL含10 mmol/L 三(2‑羧乙基)膦浓度为10 mmol/L pH 5.8的磷酸盐缓冲溶液中活化2小时，活化完毕后加入1 mL步骤（1）合成的浓度为5.8 nmol/mL金纳米溶液，立即震荡均匀并迅速裹上锡纸避光孵育16小时；接着分别往里加入11.3 μL质量百分比浓度为10% 的十二烷基硫酸钠溶液，使最终质量百分比浓度为0.1 %，加入125.7μL浓度为0.1mol/L pH 7.4 磷酸盐缓冲溶液，使其最终浓度为10 mmol/L，再加入66.16μL浓度为2 mol/L 的NaCl，使其最终浓度为0.1mol/L；在孵育24小时后使用高速离心机以10000 转/分钟离心20分钟，分散至含0.1 mol/L NaCl浓度为10 mmol/L pH 7.4 磷酸盐缓冲溶液中并重复清洗3次，去掉上清液，最后分散至含1 mL 含0.1 mol/L NaCl浓度为10 mmol/L pH 7.4 磷酸盐缓冲溶液中，震荡均匀，放置在4℃的黑暗环境中储存备用；（3）磁珠标记捕获探针MB‑CP的制备：量取1 mg磁珠置于离心管中，经过磁性分离，弃去上清，然后用100 μL TTL缓冲溶液清洗1次，该溶液中含100 mmol/L pH 8.0 Tris‑HCl、体积百分比浓度为0.1% Tween® 20、1mol/L LiCl ，接着分散至200 μL TTL缓冲溶液中，然后往溶液中加入50 μL浓度为10 μmol/L生物素修饰的DNA捕获探针CP，在室温下轻微震荡孵育15分钟，以使生物素修饰的探针与链霉亲和素包被的磁珠轻缓而充分地结合，最后使用100μL TT 缓冲溶液清洗2次，溶该液中含250 mmol/L pH 8.0 Tris‑HCl、体积百分比浓度为的0.1% Tween® 20 ，磁性分离，弃去上清液，分散至500 μL含0.2mol/L NaCl浓度为10 mmol/L pH 7.4磷酸盐缓冲溶液中储存备用；（4）探针杂交反应：移取10 μL步骤（3）中制备的浓度为10mg/mL的MB‑CP溶液、10 μL浓度范围为50 fmol/L~250 pmol/L的目标物和30 μL含0.1mol/L NaCl浓度为10 mmol/L pH 7.4磷酸盐缓冲溶液放进0.2 mL离心管，震荡混匀后置于PCR仪中30 ℃加热30 分钟，取出溶液进行磁性分离，用含0.1mol/L NaCl浓度为10 mmol/L pH 7.4 磷酸盐缓冲溶液清洗2次后，分散在50 μL含0.1mol/L NaCl 浓度为10 mmol/L pH 7.4 磷酸盐缓冲溶液溶液中，随后往溶液中加入10 μL步骤（2）中制备的浓度为5.8 nmol/mL的Au‑RP溶液，震荡混匀后置于PCR仪中在30 ℃下孵育45分钟，磁性分离，分别用100 μL含0.1mol/L NaCl 浓度为10 mmol/L pH 7.4 磷酸盐缓冲溶液、含0.1 mol/L NaNO3 10 mmol/L pH 7.4 磷酸盐缓冲溶液以及0.1 mol/L NaNO3进行清洗，去除游离的纳米金探针；（5）银染和电化学分析检测：银增强剂溶液通过混合三种溶液制备，首先制备浓度为15 mmol/L的 AgNO3，浓度为50 mmol/L的对苯二酚以及浓度为150 mmol/L的柠檬酸和50 mmol/L柠檬酸三钠，这三种溶液分别为溶液A、溶液B和溶液C，使用前的体积混合比例为1：1：1，溶液B和溶液C在银染之前的半个小时左右开始在水浴锅中保持30℃温育；在清洗后的产物中加入银染溶液并快速震荡混匀且放置在光线暗淡的环境中反应12 分钟，3分钟一次，反应完毕后立即加入50μL浓度为0.3mol/L的 Na2S2O3溶液终止反应，避免产生非特异性的沉淀；磁性分离去除上清液，加入去离子水清洗3~5次后加入100 μL 体积百分比浓度为50%的 HNO3消解30分钟；消解完毕后将溶液全部移至1.9 mL浓度为0.1 mol/L HNO3/KNO3溶液中，应用处理好的玻碳电极在 ‑0.5 V 搅拌富集5分钟，静置30 秒，利用时差脉冲溶出伏安法在 0 V ~ 0.7...
【技术特征摘要】
1.一种基于银染增强的纳米金技术检测核酸的方法，其特征在于具体步骤为：（1）纳米金合成制备：移取100mL质量百分比浓度为0.01%的氯金酸溶液倒入圆底烧瓶中，将其放置油浴锅中加热煮沸后迅速加入3mL质量百分比浓度为1%的柠檬酸钠溶液作为还原剂，继续加热15分钟，观察溶液的颜色从最初的淡黄色逐渐变成酒红色，最后停止加热冷却至室温，并且全程处于搅拌状态下进行；通过扫描电子显微镜表征可知纳米金的粒径为16nm；（2）金标记识别探针Au-RP的制备：移取60μL浓度为10μmol/L巯基修饰的DNA识别探针RP加入60μL含10mmol/L三(2-羧乙基)膦浓度为10mmol/LpH5.8的磷酸盐缓冲溶液中活化2小时，活化完毕后加入1mL步骤（1）合成的浓度为5.8nmol/mL金纳米溶液，立即震荡均匀并迅速裹上锡纸避光孵育16小时；接着分别往里加入11.3μL质量百分比浓度为10%的十二烷基硫酸钠溶液，使最终质量百分比浓度为0.1%，加入125.7μL浓度为0.1mol/LpH7.4磷酸盐缓冲溶液，使其最终浓度为10mmol/L，再加入66.16μL浓度为2mol/L的NaCl，使其最终浓度为0.1mol/L；在孵育24小时后使用高速离心机以10000转/分钟离心20分钟，分散至含0.1mol/LNaCl浓度为10mmol/LpH7.4磷酸盐缓冲溶液中并重复清洗3次，去掉上清液，最后分散至含1mL含0.1mol/LNaCl浓度为10mmol/LpH7.4磷酸盐缓冲溶液中，震荡均匀，放置在4℃的黑暗环境中储存备用；（3）磁珠标记捕获探针MB-CP的制备：量取1mg磁珠置于离心管中，经过磁性分离，弃去上清，然后用100μLTTL缓冲溶液清洗1次，该溶液中含100mmol/LpH8.0Tris-HCl、体积百分比浓度为0.1%Tween®20、1mol/LLiCl，接着分散至200μLTTL缓冲溶液中，然后往溶液中加入50μL浓度为10μmol/L生物素修饰的DNA捕获探针CP，在室温下轻微震荡孵育15分钟，以使生物素修饰的探针与链霉亲和素包被的磁珠轻缓而充分地结合，最后使用100μLTT缓冲溶液清洗2次，溶该液中含250mmol/LpH8.0Tris-HCl、体积百分比浓度为的0.1%Tween®20，磁性分离，弃去上清液，分散至500μL含0.2mol/LNaCl浓度为10mmol/LpH7.4磷酸盐缓冲溶液中储存备用；（4）探针杂交反应：移取10μL步骤（3）中制备的浓度为10mg/mL的MB-CP溶液、10μL浓度范围为50fmol/L~250pmol/L的目标物和30μL含0.1mol/LNaCl浓度为10mmol/LpH7.4磷酸盐缓冲溶液放进0.2mL离心管，震荡混匀后置于PCR仪中30℃加热...
【专利技术属性】
技术研发人员：朱文远，梁晓琳，覃永燕，周琳莹，潘宏程，
申请(专利权)人：桂林理工大学，
类型：发明
国别省市：广西,45
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