以GD2为靶点的嵌合抗原受体及药物组合物制造技术

本发明专利技术涉及生物医学领域，具体而言，涉及一种以GD2为靶点的嵌合抗原受体。所述的嵌合抗原受体由N端到C端顺次包括抗原结合区、跨膜共刺激结构域、T细胞信号传导区功能结构域以及共表达的Runx3激动因子。共表达的Runx3激动因子能显著增强CAR‑T的治疗效果。本发明专利技术还涉及一种药物组合物，所述组合物包括CAR修饰的细胞、CpG寡聚脱氧核苷酸以及缓释水凝胶；本发明专利技术所提供的药物组合物具有缓释作用，且与CpG寡聚脱氧核苷酸配合能进一步增加CAR‑T的疗效。

【技术实现步骤摘要】
以GD2为靶点的嵌合抗原受体及药物组合物
本专利技术涉及生物医学领域，具体而言，涉及以GD2为靶点的嵌合抗原受体及药物组合物。
技术介绍
CAR-T(ChimericAntigenReceptorT-CellImmunotherapy)，即嵌合抗原受体T细胞免疫疗法。该疗法是一种出现了很多年但近几年才被改良使用到临床中的新型细胞疗法。在急性白血病和非霍奇金淋巴瘤的治疗上有着显著的疗效，被认为是最有前景的肿瘤治疗方式之一。正如所有的技术一样，CAR-T技术也经历一个漫长的演化过程，正是在这一系列的演化过程中，CAR-T技术逐渐走向成熟。这种新的治疗策略的关键之处在于识别靶细胞的被称作嵌合抗原受体(CAR)的人工受体，而且在经过基因修饰后，病人T细胞能够表达这种CAR。在人体临床试验中，科学家们通过一种类似透析的过程提取出病人体内的一些T细胞，然后在实验室对它们进行基因修饰，将编码这种CAR的基因导入，这样这些T细胞就能够表达这种新的受体。这些经过基因修饰的T细胞在实验室进行增殖，随后将它们灌注回病人体内。这些T细胞利用它们表达的CAR受体结合到靶细胞表面上的分子，而这种结合触发一种内部信号产生，接着这种内部信号如此强效地激活这些T细胞以至于它们快速地摧毁靶细胞。近年来，CAR-T免疫疗法除了被用来治疗急性白血病和非霍奇金淋巴瘤之外，经改进后，也被用来治疗实体瘤、自身免疫疾病、HIV感染和移植排斥等疾病，具有更广阔的应用空间。双唾液酸神经节苷脂GD2被认为是神经母细胞瘤，骨肉瘤，黑色素瘤和肉瘤等很有潜力的标志物。2017年，《JournalofClinicalInvestigation》杂志上的研究通过修饰CAR-T细胞实现了有效治疗实体肿瘤。研究人员将CAR-T细胞和生物高分子包裹的营养物质形成的的组合制剂加入小鼠体内，可以有效地减少小鼠胰腺癌和黑色素瘤的大小，治疗效果比单独注射T细胞更为显著。然而，现有技术中以GD2为靶点的CAR-T还不够成熟，也没有将其制备成缓释药物的记载。
技术实现思路
本专利技术涉及一种以GD2为靶点的嵌合抗原受体，其由N端到C端顺次包括抗原结合区、跨膜结构区、共刺激信号传导区、T细胞信号传导区功能结构域以及共表达的Runx3激动因子；所述抗原结合区具有的重链互补决定区CDR-VH1、CDR-VH2、CDR-VH3的序列依次如SEQIDNO:1～3所示，轻链互补决定区CDR-VL1、CDR-VL2、CDR-VL3的序列依次如SEQIDNO:4～6所示；所述Runx3激动因子的氨基酸序列如SEQIDNO:7所示。本专利技术还涉及一种药物组合物，所述组合物包括如上所述的CAR修饰的细胞、CpG寡聚脱氧核苷酸以及缓释水凝胶；与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：1、与传统肿瘤治疗方法相比，该方法副作用小。2、共表达的Runx3激动因子能显著增强CAR-T的治疗效果。Runx3，可驱动T细胞离开淋巴组织，聚集在肿瘤组织中。在小鼠中提高该基因表达，可显著增强CAR-T在实体瘤中聚集。3.本专利技术所提供的药物组合物具有缓释作用，且与CpG寡聚脱氧核苷酸配合能进一步增加CAR-T的疗效。附图说明为了更清楚地说明本专利技术具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本专利技术的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为本专利技术一个实施例中各组体外杀伤对比；ANOVA，**p＜0.01，***p＜0.001，vsT细胞组；#p＜0.05，vs实验组；图2为本专利技术一个实施例中CAR-T细胞的体内验证第四周的结果；ANOVA，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，vs空白组；#p＜0.05，vs实验组。具体实施方式本专利技术涉及一种以GD2为靶点的嵌合抗原受体，其由N端到C端顺次包括抗原结合区、跨膜共刺激结构域、T细胞信号传导区功能结构域以及共表达的Runx3激动因子；所述抗原结合区具有的重链互补决定区CDR-VH1、CDR-VH2、CDR-VH3的序列依次如SEQIDNO:1～3所示，轻链互补决定区CDR-VL1、CDR-VL2、CDR-VL3的序列依次如SEQIDNO:4～6所示；所述Runx3激动因子的氨基酸序列如SEQIDNO:7所示；优选的，如上所述的嵌合抗原受体，所述跨膜共刺激结构域选自CD27，CD28，4-1BB，OX40(CD134)，CD30，CD40，PD-1，LFA-1，CD2，CD7，LIGHT，NKG2C，B7-H3蛋白分子的共刺激信号传导区、与CD3ζ特异性结合的配体或其任意组合；优选为CD28与4-1BB。优选的，如上所述的嵌合抗原受体，所述抗原结合区选自人抗体、人源化抗体或嵌合抗体；或上述抗体类型的具有抗原结合活性的功能片段。优选的，所述抗原结合区的重链骨架区序列依次如SEQIDNO:8～11所示，轻链骨架区序列依次如SEQIDNO:12～15所示；优选的，所述抗原结合区选自scFv；scFV由VI和VH连接得到，所用连接肽(linker)的序列为(GGGGS)3。优选的，如上所述的嵌合抗原受体，所述T细胞信号传导区功能结构域选自PKCθ、FcεRIγ、ZAP70或CD3ζ或其任意组合；优选的，所述T细胞信号传导区功能结构域选自CD3ζ。根据本专利技术的一方面，本专利技术还涉及一种分离的核酸分子，所述核酸分子为DNA或RNA，其编码如上所述的嵌合抗原受体。根据本专利技术的另一方面，本专利技术还涉及一种载体，其包含如上所述的核酸分子；优选的，所述载体为逆转录载体，更优选为慢病毒。根据本专利技术的另一方面，本专利技术还涉及一种制备CAR修饰的细胞的方法，所述方法包括：将如上所述的核酸分子、或如上所述的载体导入待修饰的细胞内，从而获得所述CAR修饰的细胞；根据本专利技术的另一方面，本专利技术还涉及如上所述方法制备得到的CAR修饰的细胞；优选的，所述CAR修饰的细胞为T细胞、NK细胞、CIK细胞、DC-CIK细胞。根据本专利技术的另一方面，本专利技术还涉及如上所述的载体、或如上所述的细胞在制备用于治疗GD2阳性实体瘤的治疗剂中的应用；优选的，所述GD2阳性实体瘤包括神经母细胞瘤、黑素瘤、肉瘤、脑肿瘤、骨肉瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、平滑肌肉瘤、梭形细胞肉瘤、脑肿瘤、小细胞肺癌、视网膜母细胞瘤。根据本专利技术的另一方面，本专利技术还涉及一种药物组合物，所述组合物包括如上所述的CAR修饰的细胞、CpG寡聚脱氧核苷酸以及缓释水凝胶；优选的，在所述缓释水凝胶中，所述CAR修饰的细胞的添加量为1×106～8/mL；所述CpG寡聚脱氧核苷酸的添加量为10～16μg/mL。优选的，如上所述的药物组合物，所述CpG寡聚脱氧核苷酸的序列如SEQIDNO:16所示。优选的，如上所述的药物组合物，所述缓释水凝胶为海藻酸钠与α环糊精的混合溶液形成的凝胶，其中海藻酸钠的浓度为1.5-2％(w/v)，α环糊精的浓度为0.5-0.8％(w/v)。下面将结合实施例对本专利技术的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本专利技术，而不应视为限制本专利技术的范围。实施例中本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种以GD2为靶点的嵌合抗原受体，其由N端到C端顺次包括抗原结合区、跨膜共刺激结构域、T细胞信号传导区功能结构域以及共表达的Runx3激动因子；所述抗原结合区具有的重链互补决定区CDR‑VH1、CDR‑VH2、CDR‑VH3的序列依次如SEQ ID NO:1～3所示，轻链互补决定区CDR‑VL1、CDR‑VL2、CDR‑VL3的序列依次如SEQ ID NO:4～6所示；所述Runx3激动因子的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示；优选的，所述跨膜共刺激结构域选自CD27，CD28，4‑1BB，OX40，CD30，CD40，PD‑1，LFA‑1，CD2，CD7，LIGHT，NKG2C，B7‑H3蛋白分子的共刺激信号传导区、与CD3ζ特异性结合的配体或其任意组合；更优选为CD28与4‑1BB；优选的，所述T细胞信号传导区功能结构域选自PKCθ、FcεRIγ、ZAP70或CD3ζ或其任意组合；更优选的，所述T细胞信号传导区功能结构域选自CD3ζ。

【技术特征摘要】
1.一种以GD2为靶点的嵌合抗原受体，其由N端到C端顺次包括抗原结合区、跨膜共刺激结构域、T细胞信号传导区功能结构域以及共表达的Runx3激动因子；所述抗原结合区具有的重链互补决定区CDR-VH1、CDR-VH2、CDR-VH3的序列依次如SEQIDNO:1～3所示，轻链互补决定区CDR-VL1、CDR-VL2、CDR-VL3的序列依次如SEQIDNO:4～6所示；所述Runx3激动因子的氨基酸序列如SEQIDNO:7所示；优选的，所述跨膜共刺激结构域选自CD27，CD28，4-1BB，OX40，CD30，CD40，PD-1，LFA-1，CD2，CD7，LIGHT，NKG2C，B7-H3蛋白分子的共刺激信号传导区、与CD3ζ特异性结合的配体或其任意组合；更优选为CD28与4-1BB；优选的，所述T细胞信号传导区功能结构域选自PKCθ、FcεRIγ、ZAP70或CD3ζ或其任意组合；更优选的，所述T细胞信号传导区功能结构域选自CD3ζ。2.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述抗原结合区选自人抗体、人源化抗体或嵌合抗体；或上述抗体类型的具有抗原结合活性的功能片段；优选的，所述抗原结合区的重链骨架区序列依次如SEQIDNO:8～11所示，轻链骨架区序列依次如SEQIDNO:12～15所示；优选的，所述抗原结合区选自scFv。3.一种分离的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子为DNA或RNA，其编码权利要求1...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭磊，
申请(专利权)人：杭州普略生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33