本发明专利技术涉及基因治疗领域，具体的说，就是以人胰高血糖素样肽１(7‑36)（简称GLP‑1（7‑36））基因插入到一真核表达启动子下，构建成的一种重组质粒。该质粒能在进入人体细胞，且在细胞内利用细胞本身的蛋白合成系统，合成GLP‑1(7‑36)，且能通过连接在N末端的信号肽分泌到胞外，从而起到保护β细胞，促进胰岛素分泌，治疗Ⅱ型糖尿病、肥胖症以及心脏缺血再灌注损伤的作用。
【技术实现步骤摘要】
携带人胰高血糖素样肽１(7-36)基因的重组质粒
本专利技术属于基因治疗领域，具体的说，就是以人胰高血糖素样肽1(7-36)（简称GLP-1（7-36））基因插入到一真核表达启动子下，构建成的一种重组质粒。该质粒能进入人体细胞，且在细胞内利用细胞本身的蛋白合成系统，合成GLP-1（7-36），且分泌到胞外，从而治疗Ⅱ型糖尿病和肥胖症。
技术介绍
胰高血糖素样肽1(GLP-1)是由肠道内分泌L细胞分泌的一种十分重要的肠促胰岛素，其在体内的主要生理学作用包括进食后刺激胰岛素的分泌和释放，促进胰腺β细胞的增殖并抑制其凋亡，抑制胰高血糖素的分泌，抑制胃的排空，促进饱食感产生等。GLP-1的受体分布十分广泛，除了胰腺组织外，还分布于脑、肺、心脏、肾脏等，其分布的广泛性也决定其作用的广泛性。近年来，对GLP-1的研究发现其不光对Ⅱ型糖尿病有很好的治疗作用，还对心脏具有保护作用，其很可能会为临床上糖尿病及心脏疾病的治疗带来新的希望。GLP-1不仅在人的胰岛、大脑、胃等存在着受体，在心肌细胞表面也有表达。最近有研究发现，GLP-1具有心脏保护作用，并且该作用可能与其抑制心肌细胞凋亡有关。研究表明，在心肌缺血/再灌注过程中，心肌细胞损伤不但有坏死，也存在凋亡。Kajstura等研究认为，细胞凋亡是急性心肌梗死时心肌损伤的主要形式，而细胞坏死是随后发生的。许多细胞因子及激素被发现参与了心肌细胞凋亡的过程，如胰岛素样生长因子、转化生长因子β、糖皮质激素等。最新的研究发现，GLP-1也参与了心肌细胞的凋亡过程，并且可能具有抑制心肌细胞凋亡，保护心脏作用。Lazaros等通过对急性心肌梗死和血管成形术后有收缩功能障碍的患者进行研究，发现GLP-1能够改善这些患者的左室功能。并选取急性心肌梗死患者和成功的血管成形术后左室射血分数<40%的患者，在其基本治疗的基础上以1.5pmolP(kg•min)的速度连续72h输入GLP-1，发现GLP21能够显著改善这些患者的左室射血分数、改善局部及整体的室壁运动指数，并且这种作用与发生心肌梗死的时间和部位无关，试验过程中患者只有短暂的胃肠道反应，说明GLP21具有很好的耐受性。GLP-1在治疗Ⅱ型糖尿病方面的主要作用是促进糖原分解成葡萄糖，即升高血糖的作用。目前已知的GLP-1的生理作用：血糖依赖的胰岛素促泌作用、抑制胰高血糖素的分泌、促进β细胞增殖和分化、抑制β细胞凋亡、延缓胃排空、抑制食欲、心血管保护、增强免疫和抗炎、神经保护、增强外周组织对糖的摄取、抑制肝糖输出、使中枢应激能力增强等作用。因此，GLP-1是目前市面上唯一可作为Ⅱ型糖尿病长效治疗药物的药物品种。但是，天然GLP-1易被二肽基肽酶Ⅳ（dipeptidylpeptidase-Ⅳ，DPP-Ⅳ）迅速水解失活（半衰期小于5min），不具有临床使用价值，因此对GLP-1结构修饰，形成具有同样药理活性类似物，并掩盖DPP-Ⅳ的结合位点，延长半衰期是该类药物研发的主要研究方向。如今已经有5个GLP-1类药物上市，见下表。表GLP-1类药物上市情况（亿美元）上述产品为了延长药物在体内的半衰期，均修改了GLP-1的结构，都是天然GLP-1的类似物，而这些类似物在体内长期使用后均存在产生抗体的风险。基因传递技术可以提供持续产生和分泌有生物活性的GLP-1，目前国内外研究主要有以病毒为载体的基因传递系统和非病毒基因传递系统，如下表所示。表GLP-1基因治疗项目
技术实现思路
本专利技术首先是提供一种利用裸质粒作为载体，运输GLP-1（7-36）基因到细胞内去合成、分泌GLP-1（7-36）蛋白，但以上所述的临床治疗时都是使用的GLP-1（7-36）的蛋白形式，这种方式是目前疾病治疗的常用方式，但是它的缺点是蛋白在体内的半衰期短，病人要在一段时间内多次用药，这就大大增加了病人的治疗成本，要解决这个问题，本专利技术想到了基因治疗，基因治疗中最简单有效的方法，就是选择病毒载体来携带GLP36进入细胞并表达蛋白，但正是由于病毒载体的特性，使得此种方法的安全性成为了很大的问题，特别是怕载体进入生殖细胞、干细胞等重要细胞。选用质粒载体目前大家都认为安全性比较高，但是它进入细胞很困难，人们常常得选用病毒外壳、基因枪、脂质体等外部条件协助质粒进入细胞。这就使得操作复杂，且目的蛋白的表达效果不理想，本专利技术构建出一种带有GLP-1（7-36）基因的质粒载体，该重组质粒载体是裸质粒载体，不含病毒外壳与脂质体，在使用时也不使用基因枪，仅把质粒注射到四肢部位的肌肉内即可产生GLP-1（7-36）蛋白并对胰岛素调控起作用。本专利技术其次是提供一种重组质粒载体pNL-GLP36，该质粒的第一个特征是含有GLP-1（7-36）全长氨基酸序列对应的核酸序列；第二个特征是在该质粒在目的蛋白N末端引入信号肽，并在信号肽N端加入疏水肽段的基因，以增强目的蛋白的有效分泌量；第三个特征是该质粒含有大肠杆菌内的自我复制区ColEI序列，人巨细胞病毒启动子p(CMV)序列，卡那霉素抗性基因序列，牛生长激素基因的polyA信号转录终止序列；第四个特征是该质粒具备上述两个特征后，大小没有超过4kb，使得pNL-GLP36，能利用横纹肌细胞的细胞表面的沟回结构进入肌细胞，再利用蛋白表达系统合成GLP-1（7-36），分泌到胞外并进入血液调控胰岛素，起到控制血糖水平的作用。在实验研究中，发现注射了pNL-GLP36的心肌肉组织中一个月内持续分泌GLP-1（7-36）。通过在db/db小鼠胫骨前肌注射250μg的质粒，每月一次，注射后连续观察3月。结果发现，注射后三天出现血糖降低，3个月血糖水平明显低于对照组。如果这种质粒对人类同样有效，那么这种质粒将会成为一种强有力的Ⅱ型糖尿病治疗药物。在实验研究中，通过在缺血再灌注大鼠胫骨前肌注射250μg的质粒，并连续观察一个月。结果发现，实验组大鼠心功能与心脏梗死面积较模型对照组有明显改善。四．附图说明图1是PNL-GLP36的结构图谱。图2是PNL-GLP36的纯化后纯度测定结果。图3是对大鼠模型注射PNL-GLP36，对实验动物血糖的影响结果。图4是对大鼠模型注射PNL-GLP36，对实验动物体重的影响结果。五．具体实施方式以下实例仅是为了对本专利技术的说明，而不会对本专利技术造成任何的限制。一）、裸质粒PNL-GLP36的构建首先通过全基因合成扩增出GLP36全基因序列：CACGCGGAAGGTACCTTCACCAGCGATGTGAGCAGCTATCTGGAAGGTCAGGCGGCGAAAGAATTTATCGCGTGGCTGGTGAAAGGTCGT目的片段经NheI、NotI双酶切后分别回收小片段，质粒PNL经NheI和NotI双酶切后回收大片段，18℃在T4连接酶体系中三段目的基因片断进行连接，经筛选得到的重组质粒命名为PNL-GLP36（具体结构见图1）。然后用CaCl2法转化大肠杆菌DH5a，涂布在含有50ug/ml卡那霉素的LB平板，挑选阳性菌落在LK中培养至OD600为1.5时离心收集菌体，用碱裂解法提取质粒，获得1mg质粒/克菌体。经NheI、NotI双酶切检定，切出160bp片断。所获得的的工程菌命名为PNL-GLP36/DH5α。二）、本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一类通过质粒载体介导的基因治疗重组载体，其重组质粒的序列见SEQ ID：NO1，特征为：该质粒能进入哺乳动物四肢肌肉细胞，且在肌细胞内合成、分泌人胰高血糖素样肽1（简称GLP‑1）；合成分泌的人胰高血糖素样肽1氨基酸序列为:His‑Ala‑Glu‑Gly‑Thr‑Phe‑Thr‑Ser‑Asp‑Val‑Ser‑Ser‑Tyr‑Leu‑Glu‑Gly‑Gln‑Ala‑Ala‑Lys‑Glu‑Phe ‑Ile‑Ala‑Trp‑Leu‑Val‑Lys‑Gly‑Arg。
【技术特征摘要】
1.一类通过质粒载体介导的基因治疗重组载体，其重组质粒的序列见SEQID：NO1，特征为：该质粒能进入哺乳动物四肢肌肉细胞，且在肌细胞内合成、分泌人胰高血糖素样肽1（简称GLP-1）；合成分泌的人胰高血糖素样肽1氨基酸序列为:His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg。2.根据权利要求1所述的重组质粒，其特征在于在目的蛋白GLP-1N末端引入高效信号肽，以增强目的蛋白的分泌，信号肽序列为：mtpvtpvwvtkllpalllqhvllhllllpi...
【专利技术属性】
技术研发人员：马素永，聂李亚，许松山，马杉姗，梁明征，汤晓闯，徐宏伟，
申请(专利权)人：北京诺思兰德生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11
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