一种改进的酮还原酶及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种改进的酮还原酶，属于生物催化合成技术领域。本发明专利技术所述酮还原酶突变体，所述酮还原酶突变体的氨基酸序列是SEQ ID NO:1所示氨基酸序列发生突变的氨基酸序列，发生突变的氨基酸序列突变位点分别为：第140位I突变为S，可选的突变点位至少还包括下列点位之一：第205位D突变为E、第125位H突变为Q、第329位N突变为S、第294位L突变为I、第150位D突变为Q、第36位P突变为S。本发明专利技术提供了一种酮还原酶及其应用，可以有效降低(4S)‑3‑[(5S)‑5‑(4‑氟苯基)‑5‑羟基戊酰基]‑4‑苯基‑1,3‑氧氮杂环戊烷‑2‑酮和依折麦布工业化生产的成本。

【技术实现步骤摘要】
一种改进的酮还原酶及其应用
本专利技术属于生物催化合成
，具体而言，涉及一种改进的酮还原酶及其在制备依折麦布手性中间体(4S)-3-[(5S)-5-(4-氟苯基)-5-羟基戊酰基]-4-苯基-1,3-氧氮杂环戊烷-2-酮的方法。
技术介绍
依折麦布（Ezetimibe），化学名为：(3R,4S)-1-(4-氟苯基)-3-[(3S)-3-(4-氟苯基)-3-羟丙基]-4-(4-羟苯基)-2-氮杂环丁酮，是由先灵葆雅公司和默克共同开发并于2002年上市的第一个胆固醇选择性吸收抑制剂药物，商品名为Ezetrol（益适纯）。(4S)-3-[(5S)-5-(4-氟苯基)-5-羟基戊酰基]-4-苯基-1,3-氧氮杂环戊烷-2-酮作为依折麦布原料药合成中的关键手性中间体，目前已报道的制备工艺中最具优势的是利用羰基还原酶催化5-((4S)-2-氧代-4-苯基(1,3-恶唑烷-3-基))-1-(4-氟苯基)戊烷-1,5-二酮进行制备，可以达到较高的光学纯度和转化率。贺沁婷（CN201710285381.6）利用解淀粉芽孢杆菌（Bacillusamyloliquefaciens）发酵的羰基还原酶，将5-((4S)-2-氧代-4-苯基(1,3-恶唑烷-3-基))-1-(4-氟苯基)戊烷-1,5-二酮在管氏反应器中循环反应生成(4S)-3-[(5S)-5-(4-氟苯基)-5-羟基戊酰基]-4-苯基-1,3-氧氮杂环戊烷-2-酮，底物转化率可达99.5%，产物纯度可达99.5%，但底物浓度最高仅为25g/L。郑国钧（CN201610067795.7）利用大肠杆菌全细胞催化5-((4S)-2-氧代-4-苯基(1,3-恶唑烷-3-基))-1-(4-氟苯基)戊烷-1,5-二酮合成(4S)-3-[(5S)-5-(4-氟苯基)-5-羟基戊酰基]-4-苯基-1,3-氧氮杂环戊烷-2-酮，e.e.值可达99.5%，但转化率仅为70%。艾米丽-穆德弗（CN200980141486.8）以高加索酸奶乳杆菌（Lactobacilluskefir）和微小乳杆菌（Lactobacillusminor）中的天然酮还原酶进化出一系列突变体，得到了可以催化5-((4S)-2-氧代-4-苯基(1,3-恶唑烷-3-基))-1-(4-氟苯基)戊烷-1,5-二酮合成(4S)-3-[(5S)-5-(4-氟苯基)-5-羟基戊酰基]-4-苯基-1,3-氧氮杂环戊烷-2-酮的醇脱氢酶，具体表现为100g/L5-((4S)-2-氧代-4-苯基(1,3-恶唑烷-3-基))-1-(4-氟苯基)戊烷-1,5-二酮，2g/L酶粉，体系反应24hr底物转化率≥98%，产物e.e.值≥99%。贺沁婷利用B.amyloliquefaciens发酵的羰基还原酶催化5-((4S)-2-氧代-4-苯基(1,3-恶唑烷-3-基))-1-(4-氟苯基)戊烷-1,5-二酮合成(4S)-3-[(5S)-5-(4-氟苯基)-5-羟基戊酰基]-4-苯基-1,3-氧氮杂环戊烷-2-酮中，虽然转化率和产物纯度较高，但底物浓度较低，不利于放大生产，生产成本也偏高。郑国钧使用的大肠杆菌全细胞催化工艺中，底物转化率较低，无法规模化使用。艾米丽-穆德弗的突变体酶催化效果有所提升，但仍存在酶用量大和转化效率不够高等问题，导致(4S)-3-[(5S)-5-(4-氟苯基)-5-羟基戊酰基]-4-苯基-1,3-氧氮杂环戊烷-2-酮的酶法生产成本偏高。继续筛选不同生物来源的酮还原酶并借助蛋白质工程方法对酶分子进行改造获得更加高效的酮还原酶突变体是实现依折麦布手性中间体(4S)-3-[(5S)-5-(4-氟苯基)-5-羟基戊酰基]-4-苯基-1,3-氧氮杂环戊烷-2-酮酶法工业化生产的努力方向。
技术实现思路
本专利技术基于Thermoanaerobacterbrockii(T.brockii)天然酮还原酶而改进的酮还原酶及其编码基因，利用经分子体外进化的酮还原酶突变体催化前体酮合成依折麦布手性中间体。技术方案本专利技术一方面提供了一种改进的酮还原酶，即酮还原酶突变体，该酮还原酶突变体的酶活性和立体选择性均高于野生型酮还原酶。本专利技术的技术方案是，一种酮还原酶突变体，其特征是，所述酮还原酶突变体的氨基酸序列是SEQIDNO:1所示氨基酸序列发生突变的氨基酸序列，发生突变的氨基酸序列突变位点分别为：第140位I突变为S，可选的突变点位至少还包括下列点位之一：第205位D突变为E、第125位H突变为Q、第329位N突变为S、第294位L突变为I、第150位D突变为Q、第36位P突变为S。本专利技术所述酮还原酶突变体的氨基酸序列为：SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6或SEQIDNO:7所示的氨基酸序列。根据本专利技术的一方面，提供了一种基因，该基因编码上述任一种酮还原酶突变体，基因的核苷酸序列为SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13或SEQIDNO:14。根据本专利技术的另一方面，提供了一种重组质粒，重组质粒上含有上述任一种基因的核苷酸序列，进一步地，质粒为pET-28a(+)、pET-28b(+)、pET-28c(+)、pET-5b(+)、pET-15b、pET-24a(+)、pET-24c(+)、pET-24d(+)、pET-25b(+)、pET-27b(+)、pET-28c(+)、pET-29a(+)、pET-29b(+)、pET-29c(+)、pET-30b(+)、pET-30c(+)、pET-30Xa/LIC、pET-30EK/LIC、pET-31b(+)、pET-32b(+)、pET-32c(+)、pET-32EK/LIC、pET-32Xa/LIC、pET-33b(+)、pET-37b(+)、pET-39b(+)、pET-40b(+)、pET-41a(+)、pET-41b(+)、pET-42b(+)、pET-42c(+)、pET-43.1a(+)、pET-43.1b(+)、pET-43.1c(+)、pET-43.1EK/LIC、pET-44a(+)、pET-44b(+)、pET-44c(+)、pET-44EK/LIC、pET-45b(+)、pET-46EK/LIC、pET-47b(+)、pET-48b(+)、pET-49b(+)、pET-51b(+)、pET-52b(+)、pQE30、pQE31、pQE32、pQE40、pBV220、pBV221、pCold-GST、pColdIV、pCold-GST或pTrcHisC。根据本专利技术的再一方面，提供了一种宿主细胞，宿主细胞内含有上述任一种重组质粒，且所述宿主细胞包括原核细胞、酵母或真核细胞，原核细胞优选为大肠杆菌BL21(DE3)细胞。根据本专利技术的又一方面，提供了一种生产(4S)-3-[(5S)-5-(4-氟苯基)-5-羟基戊酰基]-4-苯基-1,3-氧氮杂环戊烷-2-酮的方法，包括酮还原酶对5-((4S)-2-氧代-4-苯基(1,3-恶唑烷-3-基))-1-(4-氟苯基)戊烷-1,5-二酮进行催化加氢以形成(4S)-3-[(5S)-5-(4-氟苯基)-5本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种酮还原酶突变体，其特征在于，该酮还原酶突变体的氨基酸序列是SEQ ID NO: 1所示氨基酸序列发生突变的氨基酸序列，发生突变的氨基酸序列突变位点分别为：第140位I突变为S，可选的突变点位至少还包括下列点位之一：第205位D突变为E、第125位H突变为Q、第329位N突变为S、第294位L突变为I、第150位D突变为Q、第36位P突变为S。

【技术特征摘要】
1.一种酮还原酶突变体，其特征在于，该酮还原酶突变体的氨基酸序列是SEQIDNO:1所示氨基酸序列发生突变的氨基酸序列，发生突变的氨基酸序列突变位点分别为：第140位I突变为S，可选的突变点位至少还包括下列点位之一：第205位D突变为E、第125位H突变为Q、第329位N突变为S、第294位L突变为I、第150位D突变为Q、第36位P突变为S。2.根据权利要求1所述酮还原酶突变体，其特征在于，具有下列之一编码的氨基酸序列：SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6或SEQIDNO:7。3.根据权利要求1所述的酮还原酶突变体，其特征在于，对应的编码基因具有下述之一的核苷酸序列：SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13或SEQIDNO:14。4.一种重组质粒，其特征在于，含有权利要求3所述的酮还原酶突变体编码基因。5.根据权利要求4所述的重组质粒，其特征在于，所述质粒为pET-28a(+)、pET-28b(+)、pET-28c(+)、pET-5b(+)、pET-15b、pET-24a(+)、pET-24c(+)、pET-24d(+)、pET-25b(+)、pET-27b(+)、pET-28c(+)、pET-29a(+)、pET-29b(+)、pET-29c(+)、pET-30b(+)、pET-30c(+)、pET-30Xa/LIC、pET-30EK/LIC...

【专利技术属性】
技术研发人员：夏俊刚，金宁，
申请(专利权)人：迪沙药业集团天津药物研究有限公司，迪沙药业集团有限公司，
类型：发明
国别省市：天津,12