一种高产L-高丝氨酸的重组大肠杆菌及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种高产L‑高丝氨酸的重组大肠杆菌及其应用，本发明专利技术首先通过通过中断metI以实现L‑蛋氨酸输入系统MetD的部分失活，其次通过敲除负调控转录因子MetJ以解除其对L‑高丝氨酸合成代谢路径中相关基因的阻遏抑制作用。通过敲除metB基因的表达实现阻断O‑琥珀酰‑L‑高丝氨酸往L‑蛋氨酸的生物合成，营造胞内L‑蛋氨酸饥饿环境，使得细胞能够更快地摄取并利用葡萄糖等碳源。最后通过使用Ptrc启动子替换代谢通路中metL和thrA原位启动子序列，并且同时增强了L‑高丝氨酸外运蛋白的表达及阻断了L‑高丝氨酸的内运系统。通过以上改造策略的组合，获得了高产L‑高丝氨酸的大肠杆菌菌株。

【技术实现步骤摘要】
一种高产L-高丝氨酸的重组大肠杆菌及其应用
本专利技术涉及一种重组大肠杆菌及其参与的L-高丝氨酸的发酵生产方法。
技术介绍
L-高丝氨酸不仅作为微生物体内苏氨酸、甲硫氨酸和胱硫醚等生物合成的重要中间体，可以通过酶反应转化为其它重要化工中间体，例如L-高丝氨酸是手性除草剂L-草铵膦合成过程中重要的中间体。L-蛋氨酸是生物生长的必需氨基酸，生物体细胞膜上分布有与L-蛋氨酸运输相关蛋白，E.coli中存在MetD和MetP两类专一性蛋氨酸内运输系统，MetD对蛋氨酸的亲和力高，MetP亲和力相对较低。而L-蛋氨酸营养缺陷型菌株会给造成细胞饥饿的环境，迫使细胞提高对环境中碳源的摄取和利用，例如葡萄糖。因此敲除metI以实现L-蛋氨酸内运系统MetD的部分失活，metD操纵子包含metN、metI和metQ，分别编码ABC转运蛋白元件的ATPase、蛋氨酸渗透酶、蛋氨酸结合蛋白。微生物体内由metB基因编码的胱硫醚γ合成酶可以将O-琥珀酰-L-高丝氨酸分解生成半胱氨酸，而半胱氨酸是生物体内合成甲硫氨酸的前体，而metA基因编码的高丝氨酸O-琥珀酰基转移酶，通过高丝氨酸-γ-羟基的激活及将琥珀酰-CoA的酰基转移至高丝氨酸上合成O-琥珀酰-L-高丝氨酸，为了使L-高丝氨酸能大量积累，需要对metA基因进行敲除。天冬氨酸是Ecoli合成L-高丝氨酸的重要前体物质，同时也是苏氨酸、异亮氨酸、赖氨酸及支链氨基酸的合成前体。从天冬氨酸到高丝氨酸的生物合成需要经过四步反应，其中thrA和metL编码的高丝氨酸脱氢酶和天冬氨酸激酶II属于双功能酶，除了具有天冬氨酸激酶活性，同时还有高丝氨酸脱氢酶活性，催化天冬氨酸-半醛还原成高丝氨酸。thrA、metL、lysC、asd等基因转录水平都受负调控转录因子MetJ的调节，因此，需要对metJ基因进行敲除。L-苏氨酸的生物合成以L-高丝氨酸为前体物质，经过thrB和thrC基因编码的高丝氨酸激酶和苏氨酸合成酶催化得到，而L-高丝氨酸作为L-苏氨酸合成的前体物质，L-苏氨酸的合成会消耗大量的L-高丝氨酸，因此有必要阻断或降低L-苏氨酸的合成代谢通量。此外，由rhtA基因编码的外运因子负责将L-高丝氨酸向胞外运输，而tdcC基因负责将L-高丝氨酸和L-苏氨酸等的摄取吸收。因此需要增强负责外运基因的表达，敲除负责产物内运的基因。
技术实现思路
本专利技术的目的是通过代谢工程手段改造大肠杆菌以获得高产L-高丝氨酸的重组大肠杆菌菌株及在产L-高丝氨酸中的应用。本专利技术采用的技术方案是：本专利技术提供一种高产L-高丝氨酸的重组大肠杆菌，所述重组大肠杆菌是将大肠杆菌(优选EcoliW3110)中编码L-蛋氨酸运输蛋白的metI基因、编码负调控阻遏因子的metJ基因、编码胱硫醚γ合成酶的metB基因、编码高丝氨酸激酶的thrB基因、编码高丝氨酸-O-琥珀酰基转移酶的metA基因和编码L-高丝氨酸内运蛋白的tdcC基因依次敲除后，再分别将编码高丝氨酸脱氢酶I的thrA基因、编码高丝氨酸脱氢酶II的metL基因和编码L-高丝氨酸外运蛋白的rhtA基因的启动子均替换为Ptrc启动子获得的。进一步，所述Ptrc启动子核苷酸序列为SEQIDNO.22所示。进一步，所述metI基因核苷酸序列为SEQIDNO.1所示、metJ基因核苷酸序列为SEQIDNO.3所示、metB基因核苷酸序列为SEQIDNO.5所示、thrB基因核苷酸序列为SEQIDNO.7所示、metA基因核苷酸序列为SEQIDNO.9所示、tdcC基因核苷酸序列为SEQIDNO.11所示。本专利技术还提供一种所述高产L-高丝氨酸的重组大肠杆菌在发酵产L-高丝氨酸中的应用，所述应用是将所述的重组大肠杆菌接种至发酵培养基，在30℃、180-200rpm条件下发酵培养，将培养液分离纯化，获得L-高丝氨酸。进一步，所述发酵培养基终浓度组成为：葡萄糖40g/L、磷酸二氢钾2g/L、硫酸铵17g/L、酵母粉4g/L、碳酸钙30g/L(用于调节pH)、L-苏氨酸0.2g/L、维生素B10.0001g/L、MgSO42g/L、FeSO40.005g/L、MnSO40.005g/L、ZnSO40.005g/L，溶剂为去离子水，pH值6.8。进一步，所述重组大肠杆菌发酵培养前先进行斜面活化和种子培养，将种子液以体积浓度5％的接种量接种至发酵培养基，所述斜面活化方法为：将重组大肠杆菌接种在LB平板上，在37℃培养过夜，获得斜面菌体；所述种子培养方法为：挑取斜面菌体单菌落接种至LB液体培养基中，在37℃、200rpm的条件下培养过夜，获得种子液。所述发酵培养在发酵罐中进行，通过添加补料培养基控制发酵罐中葡萄糖浓度2-10g/L；发酵条件为DO水平在30％，搅拌转速200-600rpm，通气速率控制在1-2vvm；发酵过程中控制培养温度在30℃并用体积浓度50％的氨水调节pH在6.8～7.0的范围。发酵罐中培养基组成为：葡萄糖40g/L、磷酸二氢钾2g/L、硫酸铵17g/L、酵母粉4g/L、L-苏氨酸0.2g/L、L-蛋氨酸0.2g/L、L-异亮氨酸0.2g/L、维生素B10.0001g/L、MgSO42g/L、FeSO40.005g/L、MnSO40.005g/L、ZnSO40.005g/L，溶剂为去离子水，pH值6.8；所述补料培养基组成为：葡萄糖500g/L、磷酸二氢钾12.5g/L、L-苏氨酸0.2g/L、L-蛋氨酸0.2g/L、L-异亮氨酸0.2g/L，溶剂为水。本专利技术通过敲除EcoliW3110中表达负调控转录因子MetJ的基因，以解除其对L-高丝氨酸合成代谢路径中相关基因(thrA、metL、lysC、asd等)的阻遏抑制作用；通过中断metI以实现L-蛋氨酸输入系统MetD的部分失活，并且敲除metB基因阻断了O-琥珀酰-L-高丝氨酸代谢去路中metB基因的表达，以降低胞内L-蛋氨酸的含量从而形成该必需氨基酸的饥饿环境，使得细胞能够更快地摄取并利用葡萄糖等碳源；在代谢通路中用Ptrc启动子替换了metL和thrA原位启动子序列，以提高天冬氨酸激酶II和高丝氨酸脱氢酶的表达；同时敲除L-高丝氨酸的代谢分解途径中metA基因和thrB基因，以减少L-高丝氨酸向支路氨基酸的代谢去路。此外，通过增强负责L-高丝氨酸外运的基因rhtA基因的表达，将胞内合成的产物及时运送至胞外，敲除负责L-高丝氨酸吸收的tdcC基因，以实现胞外积累L-高丝氨酸的目的。由通过以上改造策略的组合，本专利技术成功获得了高产L-高丝氨酸的重组大肠杆菌菌株。与现有技术相比，本专利技术的有益效果主要体现在：本专利技术提供一种利用代谢工程改造的高产L-高丝氨酸的重组大肠杆菌，经过改造后的重组大肠杆菌相比于野生型能够更好的利用葡萄糖等碳源物质进行L-高丝氨酸的生产，经过改造后性能最优的菌株在发酵生产L-高丝氨酸的水平相比于野生型的菌株从0g/L提高到11.2g/L。本专利技术重组大肠杆菌可以将L-高丝氨酸运送至胞外并在环境中逐渐积累，可以较好维持胞内L-蛋氨酸含量以适当维持胞内必需氨基酸饥饿环境的方法，并且以该前体生产工业上重要的化合物。具体实施方式下面结合具体实例对本专利技术做进一步详细的说明，但本专利技术并不限于以下实施例。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高产L‑高丝氨酸的重组大肠杆菌，其特征在于所述重组大肠杆菌是将大肠杆菌中编码L‑蛋氨酸运输蛋白的metI基因、编码负调控阻遏因子的metJ基因、编码胱硫醚γ合成酶的metB基因、编码高丝氨酸激酶的thrB基因、编码高丝氨酸‑O‑琥珀酰基转移酶的metA基因和编码L‑高丝氨酸内运蛋白的tdcC基因依次敲除后，再分别将编码高丝氨酸脱氢酶I的thrA基因、编码高丝氨酸脱氢酶II的metL基因和编码L‑高丝氨酸外运蛋白的rhtA基因的启动子均替换为Ptrc启动子获得的。

【技术特征摘要】
1.一种高产L-高丝氨酸的重组大肠杆菌，其特征在于所述重组大肠杆菌是将大肠杆菌中编码L-蛋氨酸运输蛋白的metI基因、编码负调控阻遏因子的metJ基因、编码胱硫醚γ合成酶的metB基因、编码高丝氨酸激酶的thrB基因、编码高丝氨酸-O-琥珀酰基转移酶的metA基因和编码L-高丝氨酸内运蛋白的tdcC基因依次敲除后，再分别将编码高丝氨酸脱氢酶I的thrA基因、编码高丝氨酸脱氢酶II的metL基因和编码L-高丝氨酸外运蛋白的rhtA基因的启动子均替换为Ptrc启动子获得的。2.如权利要求1所述高产L-高丝氨酸的重组大肠杆菌，其特征在于所述Ptrc启动子核苷酸序列为SEQIDNO.22所示。3.如权利要求1所述高产L-高丝氨酸的重组大肠杆菌，其特征在于所述metI基因核苷酸序列为SEQIDNO.1所示、metJ基因核苷酸序列为SEQIDNO.3所示、metB基因核苷酸序列为SEQIDNO.5所示、thrB基因核苷酸序列为SEQIDNO.7所示、metA基因核苷酸序列为SEQIDNO.9所示、tdcC基因核苷酸序列为SEQIDNO.11所示。4.一种权利要求1所述高产L-高丝氨酸的重组大肠杆菌在发酵产L-高丝氨酸中的应用。5.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述应用是将所述的重组大肠杆菌接种至发酵培养基，在30℃、180-200rpm条件下发酵培养，将培养液分离纯化，获得L-高丝氨酸。6.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述发酵培养基终浓度组成为：葡萄糖40g/L、磷酸二氢钾2g/L、硫酸铵17g/L、酵母粉4g/L、碳酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：柳志强，郑裕国，张博，刘鹏，金利群，黄建峰，沈臻旸，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33