一种副鸡禽杆菌的血凝抑制抗原的制备方法及抗原的应用技术

本发明专利技术提供了一种副鸡禽杆菌血凝抑制抗原、抗原的制备方法及应用。所述抗原是将副鸡禽杆菌中加入有猪葡萄球菌过滤液处理后制备获得。所述副鸡禽杆菌血凝抑制抗原可用于在检测鸡副鸡禽杆菌抗体中的应用，具体可用于制备血凝试验或血凝抑制试验的试剂及试剂盒及其它免疫学检测方法及试剂。制备的副鸡禽杆菌血凝抑制抗原稳定、血凝效价高，用于血凝试验和血凝抑制试验时，结果更加稳定、易判，可操作性强。

【技术实现步骤摘要】
一种副鸡禽杆菌的血凝抑制抗原的制备方法及抗原的应用
本专利技术属于生物
，具体涉及一种副鸡禽杆菌的血凝抑制抗原的制备方法及抗原的应用。
技术介绍
副鸡禽杆菌(Avibacteriumparagallinarum，A.paragallinarum)是鸡传染性鼻炎的病原菌，能够引起鸡的急性上呼吸道传染病。鸡的急性上呼吸道传染病在世界上许多地方都有发生和流行，我国从1980年起就有许多疑似本病的病例出现，首先由冯文达于1987年在北京分离到细菌。该病发生后可引起蛋鸡产蛋量下降，育成鸡生长发育受阻和淘汰率增加，肉鸡肉质下降，造成很大的经济损失。在现有的副鸡禽杆菌的血清学检测方法中，常采用KSCN/Nacl处理菌体作为抗原，菌体量相同情况下抗原效价低，而且抗原不稳定，存在失去血凝活性的现象，保存期非常短，不经济。
技术实现思路
为了解决上述技术问题，本专利技术提供一种副鸡禽杆菌血凝抑制抗原的制备方法，制备的抗原可用于制备检测副鸡禽杆菌血凝抑制抗体的血凝及血凝抑制检测试剂盒，并用于血凝试验和血凝抑制试验的检测。为实现上述目的，本专利技术采用以下的技术方案为：一种副鸡禽杆菌血凝抑制抗原的制备方法，其包括如下步骤：S1、培养副鸡禽杆菌获得菌液，S2、将副鸡禽杆菌菌液离心并用PBS洗涤沉淀，之后用PBS稀释获得副鸡禽杆菌PBS悬浮液，加入猪葡萄球菌滤液，混匀，经一定温度和时间处理；S3、步骤S2处理后的溶液经离心取沉淀后，用PBS洗涤、稀释，然后冰浴中超声波裂解，之后用100目的金属过滤器过滤留滤液，获得副鸡禽杆菌血凝抑制抗原。如上所述的制备方法，优选地，在步骤S1中，所述菌液的OD600值≥0.9；在步骤S2中，所述离心的速率采用8000×g，离心10min，100mL菌液离心的沉淀用20～30mLPBS悬浮。如上所述的制备方法，优选地，在步骤S2中，所述猪葡萄球菌滤液为猪葡萄球菌在LB液体培养基中过夜培养后，待OD600值≥1.0收获菌液，离心取上清液用0.22μm滤器过滤后的液体；所述猪葡萄球菌滤液的加入量为所述副鸡禽杆菌PBS悬浮液体积的10％～20％。如上所述的制备方法，优选地，在步骤S2中，所述一定温度和时间处理为在37℃震荡1.5～3小时，再4℃作用24～48小时。如上所述的制备方法，优选地，在步骤S3中，所述超声波裂解的功率为600W，作用1s，间隔2s，共裂解10min。进一步，保证副鸡禽杆菌血凝抑制抗原可长期存放，防止污染其它霉菌或变质，优选在所述抗原中加入0.01％硫柳汞。如上所述的制备方法，优选地，将所述副鸡禽杆菌血凝抑制抗原中加有抗原稳定剂，所述抗原稳定剂中按终浓度体积百分比为3.5％的甘油，按终浓度为质量百分比2.5％的多胨和1％的甘氨酸。本专利技术在制备好的血凝抑制抗原中添加了不同配方的抗原保护剂，比较了13种抗原保护剂配方，最终确定体积百分比3.5％甘油，质量百分比为2.5％多胨和质量百分比为1％的甘氨酸对抗原的保存效果最佳，4℃保存温度下抗原的保存期可长达24个月。本专利技术还提供一种抗原稳定剂，所述抗原稳定剂中包括体积百分比为3.5％的甘油、质量百分比为2.5％的多胨和1％的甘氨酸。如上所述制备方法制备获得的副鸡禽杆菌血凝抑制抗原用于检测鸡副鸡禽杆菌抗体中的应用。如上所述的应用，包括用于制备检测鸡副鸡禽杆菌抗体的检测试剂及试剂盒，所述检测试剂及试剂盒包括血清学检测方法的试剂及试剂盒，进一步，优选血凝试验或血凝抑制试验的试剂及试剂盒。如上所述的应用，所述副鸡禽杆菌血凝抑制抗原用于鸡副鸡禽杆菌抗体的血凝抑制试验时，所述副鸡禽杆菌血凝抑制抗原添加有牛血清白蛋白V，在醛化红血球PBS稀释液中添加有tween-20以及牛血清白蛋白V。一种快速、特异性强、敏感性高的鸡副鸡禽杆菌抗体的血凝抑制抗体检测方法：S1、将健康非免疫公鸡的红细胞进行醛化，获得10％醛化红细胞和1％醛化红细胞；S2、被检血清、阳性血清和阴性血清用10％醛化红细胞做1：5稀释，室温下作用4h然后4℃过夜，中间充分振荡，然后1500×g离心5min，取上清即为5倍稀释的被检血清、阳性血清和阴性血清；S3、5倍稀释的被检血清、阳性血清和阴性血清加入96孔V型微量板的孔中，做2倍系列稀释。S4、向孔中加入上述制备的副鸡禽杆菌血凝抑制抗原，充分振荡后静置40分钟；S5、继续向所述V型微量板孔中加入步骤S1中所述1％醛化红细胞；混匀后，静置40～60分钟或者37℃静置40分钟，至醛化红细胞对照孔红细胞完全下沉为准；S6、判断结果：在阳性血清的红细胞平铺于孔底为红细胞完全凝集和阴性血清的红细胞集中在孔底中央呈圆点状的前提下：阴性：红细胞平铺于孔底为红细胞完全凝集，则被检血清中不含有鸡副鸡禽杆菌抗体；说明被检血清的鸡只没有被鸡副鸡禽杆菌免疫或感染；阳性：红细胞集中在孔底中央呈圆点状为红细胞凝集被抑制，则被检血清中含有鸡副鸡禽杆菌抗体；说明被检血清的鸡只被鸡副鸡禽杆菌免疫或感染过。只有在阳性血清会发生红细胞集中在孔底中央呈圆点状为红细胞凝集被抑制和阴性血清的红细胞平铺于孔底为红细胞完全凝集的前提下：说明本专利技术检测方法准确可靠，如果不符合说明检测试剂有污染或操作不当，检测结果是不可信的，应重新实验检测。如上所述的方法，所述制备10％醛化红细胞的具体操作为：S101、采集健康非免疫公鸡的抗凝全血，用生理盐水洗涤沉淀5遍，之后加入磷酸缓冲液配成体积比为10％的红细胞悬液；S102、取红细胞悬液体积比的5％的戊二醛(50％)，将其用PBS稀释至5％的浓度，在搅拌状态下向10％的红细胞悬液加入5％戊二醛的PBS溶液，在2～8℃持续搅拌2小时；S103、以1000×g离心10分钟，弃上清，沉淀用PBS清洗3次，然后用PBS将沉淀配成体积比为10％的红细胞悬液，制成10％的醛化红细胞；S104、用含tween-20和牛血清白蛋白V的PBS缓冲液将10％醛化红细胞稀释为1％醛化红细胞。本专利技术在进行血凝试验和血凝抑制试验时，采用的副鸡禽杆菌血凝抑制抗原PBS稀释液中添加牛血清白蛋白V，在醛化红血球PBS稀释液中添加tween-20以及牛血清白蛋白V，从试验结果的稳定性方面和结果的易判角度出发，添加这两种成分后血凝试验和血凝抑制试验的结果更加稳定、易判，可操作性强。本专利技术的有益效果在于：与以往检测技术相比，本专利技术有以下优点：(1)本专利技术制备的副鸡禽杆菌血凝抑制抗原采用猪葡萄球菌滤液处理，这种处理方法可以将副鸡禽杆菌表面的荚膜处理掉，使它的血凝抗原表位充分的暴露于菌体表面，从而表现优异的血凝活性。与现有技术报导的KSCN/NaCl溶液处理的方法相比，血凝抑制抗原血凝效价高，而且处理后的抗原更稳定。本专利技术的副鸡禽杆菌血凝抑制抗原具有血凝活性，能够使鸡醛化红血球发生凝集。在鸡体存在副鸡禽杆菌抗体的情况下，该抗原的凝集鸡醛化红血球的特性可以被抑制。(2)本专利技术在进行血凝试验和血凝抑制试验时，采用的血凝抗原PBS稀释液中添加牛血清白蛋白V，在醛化红血球PBS稀释液中添加tween-20以及牛血清白蛋白V，使血凝试验和血凝抑制试验中的醛化红血球的沉淀和聚集性更好，从而使血凝抑制试验的结果更加稳定、易判，可操作性强。(3)本专利技术制备好的副鸡禽杆菌血凝抑制抗原添加了独特的抗原稳定剂本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种副鸡禽杆菌血凝抑制抗原的制备方法，其特征在于，其包括如下步骤：S1、培养副鸡禽杆菌获得菌液；S2、将副鸡禽杆菌菌液离心并用PBS洗涤沉淀，之后用PBS稀释获得副鸡禽杆菌PBS悬浮液，加入猪葡萄球菌滤液，混匀，经一定温度和时间处理；S3、步骤S2处理后的溶液经离心取沉淀后，用PBS洗涤、稀释，然后冰浴中超声波裂解，之后用100目的金属过滤器过滤留滤液，获得副鸡禽杆菌血凝抑制抗原。

【技术特征摘要】
1.一种副鸡禽杆菌血凝抑制抗原的制备方法，其特征在于，其包括如下步骤：S1、培养副鸡禽杆菌获得菌液；S2、将副鸡禽杆菌菌液离心并用PBS洗涤沉淀，之后用PBS稀释获得副鸡禽杆菌PBS悬浮液，加入猪葡萄球菌滤液，混匀，经一定温度和时间处理；S3、步骤S2处理后的溶液经离心取沉淀后，用PBS洗涤、稀释，然后冰浴中超声波裂解，之后用100目的金属过滤器过滤留滤液，获得副鸡禽杆菌血凝抑制抗原。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤S1中，所述菌液的OD600值≥0.9；在步骤S2中，所述离心的速率采用8000×g，离心10min，100mL菌液离心的沉淀用20～30mLPBS悬浮。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤S2中，所述猪葡萄球菌滤液为猪葡萄球菌在LB液体培养基中过夜培养后，待OD600值≥1.0收获菌液，离心取上清液用0.22μm滤器过滤后的液体；所述猪葡萄球菌滤液的加入量为所述副鸡禽杆菌PBS悬浮液体积的10％～20％。4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙惠玲，陈小玲，程晶，徐福洲，
申请(专利权)人：北京市农林科学院，
类型：发明
国别省市：北京,11