用于厌氧产生L-天冬氨酸和β-丙氨酸的重组宿主细胞和方法技术

用于在基本上厌氧的条件下生物产生L‑天冬氨酸和/或β‑丙氨酸的重组宿主细胞、材料和方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于厌氧产生L-天冬氨酸和β-丙氨酸的重组宿主细胞和方法相关申请的交叉引用本申请要求于2015年11月12日提交的标题为“RECOMBINANTHOSTCELLSANDMETHODSFORTHEANAEROBICPRODUCTIONOFL-ASPARTATEANDBETA-ALANINE”的美国临时专利申请系列号62/254,635的优先权，其完整公开内容通过引用明确地并入本文。政府利益本专利技术是在美国能源部授予的授予号DE-EE0007565的政府支持下完成的。政府对本专利技术享有一定的权利。
技术介绍
与石油化学工业相关的长期经济和环境顾虑已为增加对用于使碳原料转化成可替代由石油原料产生的化学品的化学品的方法的研究、开发和商业化提供推动力。一种方法是开发用以使可再生原料转化成可替代石油衍生化学品的产品的生物精制方法。改进生物精制方法的两个共同目标包括实现较低生产成本和降低二氧化碳排放。天冬氨酸(“L-天冬氨酸酯”，CAS号56-84-8)目前是由富马酸(不可再生的石油衍生的化学原料)产生的。同样，β-丙氨酸(CAS编号107-96-9)由丙烯酰胺(另一种不可再生的石油原料)产生。工业合成L-天冬氨酸和L-天冬氨酸衍生的化合物的当前优选途径是基于富马酸的。例如，其中L-天冬氨酸氨裂解酶催化由富马酸和氨形成L-天冬氨酸的酶促过程(参见“AminoAcids,”In:Ullmann’sEncyclopediaofIndustrialChemistry,Wiley-VCH,Weinheim,NewYork(2002))。现有的基于石化的L-天冬氨酸和β-丙氨酸产生路线是环境破坏性的，取决于不可再生的原料，并且是昂贵的。因此，仍然需要用于将可再生原料生物催化转化成L-天冬氨酸和/或β-丙氨酸并纯化生物合成的L-天冬氨酸和/或β-丙氨酸的方法和材料。专利技术概述在第一方面，本专利技术提供了能够在基本上厌氧的条件下产生L-天冬氨酸或β-丙氨酸的重组宿主细胞，所述宿主细胞包含一种或多种编码L-天冬氨酸途径酶和任选地(在产生β-丙氨酸的宿主细胞的情况下)L-天冬氨酸1-脱羧酶的异源核酸。在一个实施方案中，重组宿主细胞已经工程化以在基本上厌氧的条件下产生L-天冬氨酸或β-丙氨酸。在本专利技术的方法的实践中可以使用任何合适的宿主细胞，用于本文提供的组合物和方法的示例性宿主细胞包括古细菌、原核或真核细胞。在一个重要的实施方案中，重组宿主细胞是酵母细胞。在某些实施方案中，本文提供的重组酵母细胞通过将一个或多个遗传修饰(包括例如编码酶的异源核酸和/或编码酶的天然核酸的破坏或缺失)引入Crabtree阴性酵母细胞。在某些这些实施方案中，宿主细胞属于毕赤酵母属(Pichia)/伊萨酵母属(Issatchenkia)/Saturnispora/德克酵母属(Dekkera)进化枝。在某些这些实施方案中，宿主细胞属于选自毕赤酵母属、伊萨酵母属或念珠菌属的属。在某些实施方案中，宿主细胞属于毕赤酵母属，并且在这些实施方案的一些中，宿主细胞是库德里阿兹威毕赤酵母(Pichiakudriavzevii)。本文在某些实施方案中提供了具有至少一种从磷酸烯醇丙酮酸或丙酮酸到L-天冬氨酸的活性L-天冬氨酸途径的重组宿主细胞。在其中宿主细胞产生β-丙氨酸的一些实施方案中，重组宿主细胞进一步表达L-天冬氨酸1-脱羧酶。在某些实施方案中，本文提供的重组宿主细胞具有经由磷酸烯醇丙酮酸或丙酮酸和草酰乙酸中间体进行的L-天冬氨酸途径。在许多实施方案中，重组宿主细胞包含一种或多种编码一种或多种选自磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶和L-天冬氨酸脱氢酶的L-天冬氨酸途径酶的异源核酸，其中异源核酸以足以在基本厌氧的条件下产生L-天冬氨酸的量表达。在其他实施方案中，重组宿主细胞包含一种或多种编码一种或多种选自磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶和L-天冬氨酸脱氢酶的L-天冬氨酸途径酶的异源核酸，其中异源核酸以足以在好氧条件下产生L-天冬氨酸的量表达。在一个实施方案中，重组宿主细胞包含编码选自丙酮酸羧化酶和L-天冬氨酸脱氢酶的一种或多种L-天冬氨酸途径酶的一种或多种异源核酸，其中异源核酸以足以在基本上厌氧的条件下产生L-天冬氨酸的量表达。在一个实施方案中，重组宿主细胞包含编码选自丙酮酸羧化酶和L-天冬氨酸脱氢酶的一种或多种L-天冬氨酸途径酶的一种或多种异源核酸，其中异源核酸以足以在好氧条件下产生L-天冬氨酸的量表达。在某些实施方案中，细胞还包含编码L-天冬氨酸1-脱羧酶的异源核酸，其中所述异源核酸以足以在基本厌氧的条件下产生β-丙氨酸的量表达。在一些实施方案中，本文提供的重组宿主细胞包含编码L-天冬氨酸脱氢酶的异源核酸。在某些实施方案中，本文提供的重组宿主细胞包含编码铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)L-天冬氨酸脱氢酶(SEQIDNO：1)的异源核酸并且能够产生L-天冬氨酸和/或β-丙氨酸。在其他实施方案中，本文提供的重组宿主细胞包含编码CupriavidustaiwanensisL-天冬氨酸脱氢酶的异源核酸(SEQIDNO：2)并且能够产生L-天冬氨酸和/或β-丙氨酸。在各种实施方案中，重组宿主细胞还包含编码L-天冬氨酸1-脱羧酶的异源核酸，并且能够在合适条件下培养时产生β-丙氨酸。本文使用的L-天冬氨酸1-脱羧酶是指具有L-天冬氨酸脱羧酶活性(意指催化L-天冬氨酸脱羧成β-丙氨酸的能力)的任何蛋白质。在各种实施方案中，本文提供的重组宿主细胞包含一种或多种编码选自枯草芽孢杆菌L-天冬氨酸1-脱羧酶(SEQIDNO：5)，棒状杆菌(Corynebacterium)L-天冬氨酸1-脱羧酶(SEQIDNO：4)和/或赤拟谷盗(Triboliumcastaneum)L-天冬氨酸1-脱羧酶(SEQIDNO：3)的L-天冬氨酸1-脱羧酶的异源核酸并且能够产生β-丙氨酸。在各种实施方案中，适合根据本专利技术的方法使用的L-天冬氨酸脱氢酶具有L-天冬氨酸脱氢酶活性并且包含与SEQIDNO：14具有至少55％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％或至少95％序列同一性的氨基酸序列。在各种实施方案中，适合根据本专利技术的方法使用的L-天冬氨酸1-脱羧酶具有L-天冬氨酸1-脱羧酶活性并且包含与SEQIDNO：15和/或16具有至少40％，至少45％，至少50％或至少55％序列同一性的氨基酸序列。在第二方面，本专利技术提供了经遗传修饰以缺失内源蛋白质或以其他方式降低内源蛋白质活性的宿主细胞。乙醇发酵途径和编码乙醇发酵途径酶的核酸的缺失或破坏对于工程化能够在基本上厌氧的条件下有效产生L-天冬氨酸和/或β-丙氨酸的重组宿主细胞是重要的。在各种实施方案中，包含编码乙醇发酵途径酶的一种或多种核酸的缺失或破坏的重组宿主细胞使乙醇产量减少至少10％，至少25％，至少50％，至少60％，至少70％，至少90％，至少95％或至少99％，与不包含该遗传修饰的亲本细胞相比。在多个实施方案中，重组宿主细胞包含编码选自丙酮酸脱羧酶、醇脱氢酶和/或苹果酸脱氢酶的酶的一种或多种核酸的缺失或破坏。在第三方面，本专利技术提供了用于通过本专利技术的重组宿主细胞产生L-天冬氨酸或本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.重组酵母细胞，其包含：(a)编码L‑天冬氨酸脱氢酶的异源核酸；和(b)编码草酰乙酸形成酶的异源核酸，所述草酰乙酸形成酶选自丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶和磷酸烯醇丙酮酸羧激酶。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.11.12 US 62/254,6351.重组酵母细胞，其包含：(a)编码L-天冬氨酸脱氢酶的异源核酸；和(b)编码草酰乙酸形成酶的异源核酸，所述草酰乙酸形成酶选自丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶和磷酸烯醇丙酮酸羧激酶。2.权利要求1的重组酵母细胞，其中编码草酰乙酸形成酶的异源核酸是丙酮酸羧化酶。3.重组酵母细胞，其包含：(a)编码L-天冬氨酸脱氢酶的异源核酸；(b)编码草酰乙酸形成酶的异源核酸，所述草酰乙酸形成酶选自丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇...

【专利技术属性】
技术研发人员：J·迪特里希，
申请(专利权)人：利戈斯股份有限公司，
类型：发明
国别省市：美国,US