经修饰的六酰化奈瑟球菌LPS制造技术

本发明专利技术涉及具有六酰化的脂质A部分的奈瑟球菌LPS，其中与野生型奈瑟球菌LPS的脂质A部分相比，六酰化的脂质A部分是经修饰的，因为它包含在脂质A部分的非还原末端处的葡糖胺上的棕榈油酰基代替月桂酰基二级酰基链。本发明专利技术进一步涉及六酰化LPS与相应的五酰化LPS的混合物，其缺乏在脂质A部分的非还原末端的葡糖胺上的二级酰基链。本发明专利技术还涉及这样的奈瑟球菌，其已进行遗传修饰，以降低内源lpxL1基因的表达，并且引入异源热敏性lpxP基因的表达，用于产生六‑和五‑酰化LPS。通过选择细菌在其下生长的时间和/或温度，相对于相应的五酰化结构增加或减少六酰化的脂质A结构的量，并且从而将本发明专利技术的奈瑟球菌LPS的TLR4激动剂活性调节到对于特定免疫治疗方法所需的确切活性水平是可行的。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】经修饰的六酰化奈瑟球菌LPS
本专利技术涉及医学领域，特别是免疫学、医学微生物学和疫苗学领域。本专利技术涉及经修饰的LPS分子，其可以从生物工程脑膜炎球菌LPS突变体获得，并且可用作全细胞疫苗、OMV疫苗或者纯化的LPS或脂质A分子的部分。
技术介绍
脂多糖(LPS)，也称为细菌内毒素，是革兰氏阴性菌外膜的丰富组分。在被革兰氏阴性菌感染期间，LPS或更准确地说，LPS的脂质A部分激活宿主的先天免疫系统(1-3)。这种激活通过LPS与模式识别受体Toll样受体4/髓样分化因子2(TLR4/MD-2)复合物的结合而发生，所述结合启动信号传导级联，导致清除感染必需的细胞因子产生(3,4)。然而，这种信号级联的过度刺激和炎性细胞因子的过度产生对宿主是有害的，并且可以导致危及生命的状况，例如败血症性休克(5，6)。为了完全激活TLR4/MD-2复合物，具有六个酰基链和两个磷酸基的脂质A结构是关键的(7)。然而，许多细菌物种携带可以通过改变酰基链或磷酸基的数目来改变其脂质A结构的酶，导致TLR4/MD-2复合物的激活改变(8)，甚至到成为拮抗剂而不是激动剂的点，如对于四酰化大肠杆菌(E.coli)脂质IVa结构中观察到的(7,9)。TLR4/MD-2复合物在TLR受体家族中是独特的，因为它可以通过MyD88以及TRIF途径两者来发信号。经修饰的脂质A结构可以通过优先募集MyD88或TRIF衔接子分子来诱导选择信号传导。触发I型干扰素产生的通过TRIF途径的优先信号传导被认为对于疫苗佐剂是重要的(10，11)。单磷酰脂质A(MPLA)是经修饰的脂质A的实例，其触发TRIF偏向的信号传导(11)。MPLA是来自明尼苏达沙门氏菌(Salmonellaminnesota)的异质脂质A混合物，其已进行化学解毒，并且被批准用作一些疫苗中的佐剂(12)。MPLA的主要组分由六酰化的4'-单磷酰脂质A组成。MPLA的使用具有以下缺点：对于其制备，除来自细菌的LPS分离之外，还需要化学处理，并且其仅由LPS的脂质A部分组成，使得其不溶于水。脑膜炎奈瑟球菌(Neisseriameningitidis)通常产生六酰化LPS，其中磷酸基和磷酸乙醇胺基团附着在脂质A的1和4'位置(13，14)。LPS修饰酶如PagL的异源表达或脂质A生物合成酶如LpxL1和LpxL2的缺失已用于使高活性脑膜炎球菌LPS解毒(13，15)。当制备脑膜炎球菌外膜囊泡疫苗时，LpxL1的缺失显示为用于解毒脑膜炎球菌LPS的有利方法，而无需使用去污剂来降低过量的LPS相关的反应原性(16)。然而，这种经修饰的LPS的活性已降低到它几乎不诱导人细胞上的TLR4/MD-2复合物激活的点，使其不太适合用作独立的疫苗佐剂(17)。脑膜炎奈瑟球菌中pagL的异源表达导致不同减毒的五酰化LPS结构，其仍能够诱导TLR4激活，并且在人单核细胞系上诱导TRIF偏向的细胞因子产生(13)。大肠杆菌LpxP(Genbank登录号：U49787.1)是冷休克诱导的酶，其已知将二级9-十六碳烯酸(C16:1；棕榈油酸酯)加入脂质A的2'酰基链中(27)。本专利技术的目的是提供可用作佐剂的经修饰的LPS分子，其具有在保留足够量的免疫激活同时限制毒性副作用之间的最佳平衡。本专利技术通过与脂质A生物合成基因的靶向缺失组合的LPS修饰酶的异源表达来解决该问题，以提供具有广泛范围的TLR4/MD-2激活能力的脑膜炎球菌LPS结构的多样化集合，其可用于各种预防和治疗应用中。
技术实现思路
在第一个方面，本专利技术涉及具有六酰化的脂质A部分的奈瑟球菌LPS，其中与野生型奈瑟球菌LPS的脂质A部分相比，六酰化的脂质A部分是经修饰的，因为它具有棕榈油酰基(palmitoleoyl)(代替月桂酰基)作为与在脂质A部分的非还原末端处的葡糖胺上的一级酰基链结合的二级酰基链。优选地，除了六酰化的脂质A部分外，LPS具有脑膜炎奈瑟球菌、淋病奈瑟球菌(Neisseriagonorrhoeae)或乳糖奈瑟球菌(Neisserialactamica)的LPS结构，由此更优选地，脑膜炎奈瑟球菌、淋病奈瑟球菌或乳糖奈瑟球菌是lgtB-和galE-中的至少一种，并且由此最优选地，脑膜炎奈瑟球菌是血清群B和免疫型L3中的至少一种。在根据本专利技术的优选的奈瑟球菌LPS中，六酰化的脂质A部分具有式(I)的结构(参见下文)，其中R1和R2独立地是-P(O)(OH)2、-[P(O)(OH)-O]2-H、-[P(O)(OH)-O]2-CH2CH2NH2、-[P(O)(OH)-O]3-CH2CH2NH2、-[P(O)(OH)-O]3-H或-P(O)(OH)-O-CH2CH2NH2，并且其中优选地，R1和R2独立地是-P(O)(OH)2、-[P(O)(OH)-O]2-H、-[P(O)(OH)-O]2-CH2CH2NH2或-[P(O)(OH)-O]3-CH2CH2NH2。在第二个方面，本专利技术涉及包含以下混合物的组合物：i)具有上文定义的六酰化的脂质A部分的奈瑟球菌LPS；以及ii)具有五酰化的脂质A部分的奈瑟球菌LPS，其中与野生型奈瑟球菌LPS的脂质A部分相比，所述五酰化的脂质A部分是经修饰的，因为它缺少与在脂质A部分的非还原末端处的葡糖胺上的一级酰基链结合的二级酰基链。优选地，除了五酰化的脂质A部分之外，五酰化奈瑟球菌LPS具有如上文对于六酰化LPS定义的LPS结构。更优选地，五酰化的脂质A部分具有式(II)的结构(参见下文)，其中R1和R2独立地是-P(O)(OH)2、-[P(O)(OH)-O]2-H、-[P(O)(OH)-O]2-CH2CH2NH2、-[P(O)(OH)-O]3-CH2CH2NH2、-[P(O)(OH)-O]3-H或-P(O)(OH)-O-CH2CH2NH2，并且其中优选地，R1和R2独立地是-P(O)(OH)2、-[P(O)(OH)-O]2-H、-[P(O)(OH)-O]2-CH2CH2NH2或-[P(O)(OH)-O]3-CH2CH2NH2。优选地，组合物包含摩尔比在1:400至1:1.25范围内的六酰化奈瑟球菌LPS和五酰化奈瑟球菌LPS。在第二个方面，本专利技术涉及奈瑟球菌属(Neisseria)的遗传修饰的细菌，其中所述细菌包含：a)降低或消除由内源lpxL1基因编码的脂质A生物合成月桂酰酰基转移酶活性的遗传修饰；以及b)对细菌赋予脂质A生物合成棕榈油酰基酰基转移酶活性的遗传修饰。优选地，细菌是遗传修饰的脑膜炎奈瑟球菌、淋病奈瑟球菌或乳糖奈瑟球菌。优选地，在遗传修饰的细菌中，内源lpxL1基因是编码LpxL1蛋白的基因，所述LpxL1蛋白具有与SEQIDNO：1-3中的至少一个具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，并且对细菌赋予脂质A生物合成棕榈油酰基酰基转移酶活性的遗传修饰是引入异源lpxP基因的表达的遗传修饰，所述异源lpxP基因具有编码与SEQIDNO：4-10的至少一个具有至少89％的氨基酸序列同一性的LpxP脂质A棕榈油酰基酰基转移酶的核苷酸序列。更优选地，编码LpxP脂质A棕榈油酰基酰基转移酶的核苷酸序列编码已知的冷休克诱导的LpxP棕榈油酰基酰基转移酶，其具有选自SEQIDNO：4-10的氨基酸序列。本专利技术的遗本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种具有六酰化的脂质A部分的奈瑟球菌LPS，其中与野生型奈瑟球菌LPS的脂质A部分相比，所述六酰化的脂质A部分是经修饰的，因为它具有棕榈油酰基(代替月桂酰基)作为与在所述脂质A部分的非还原末端处的葡糖胺上的一级酰基链结合的二级酰基链。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.01.28 NL 20161701.一种具有六酰化的脂质A部分的奈瑟球菌LPS，其中与野生型奈瑟球菌LPS的脂质A部分相比，所述六酰化的脂质A部分是经修饰的，因为它具有棕榈油酰基(代替月桂酰基)作为与在所述脂质A部分的非还原末端处的葡糖胺上的一级酰基链结合的二级酰基链。2.根据权利要求1的奈瑟球菌LPS，其中除了所述六酰化的脂质A部分外，LPS具有脑膜炎奈瑟球菌(Neisseriameningitidis)、淋病奈瑟球菌(Neisseriagonorrhoeae)或乳糖奈瑟球菌(Neisserialactamica)的LPS结构。3.根据权利要求2的奈瑟球菌LPS，其中所述脑膜炎奈瑟球菌、淋病奈瑟球菌或乳糖奈瑟球菌是lgtB-和galE-中的至少一种。4.根据权利要求2或3的奈瑟球菌LPS，其中所述脑膜炎奈瑟球菌是血清群B和免疫型L3中的至少一种。5.根据权利要求1-4中任一项的奈瑟球菌LPS，其中所述六酰化的脂质A部分具有式(I)的结构：其中R1和R2独立地是-P(O)(OH)2、-[P(O)(OH)-O]2-H、-[P(O)(OH)-O]2-CH2CH2NH2、-[P(O)(OH)-O]3-CH2CH2NH2、-[P(O)(OH)-O]3-H或-P(O)(OH)-O-CH2CH2NH2。6.一种组合物，其包含以下的混合物：i)具有如权利要求1-5中任一项定义的六酰化的脂质A部分的奈瑟球菌LPS；和ii)具有五酰化的脂质A部分的奈瑟球菌LPS，其中与野生型奈瑟球菌LPS的脂质A部分相比，所述五酰化的脂质A部分是经修饰的，因为它缺少与在所述脂质A部分的非还原末端处的葡糖胺上的一级酰基链结合的二级酰基链。7.根据权利要求6的组合物，其中除了五酰化的脂质A部分之外，所述五酰化奈瑟球菌LPS具有如权利要求2-4中任一项定义的LPS结构。8.根据权利要求6或7的组合物，其中所述五酰化的脂质A部分具有式(II)的结构：其中R1和R2独立地是-P(O)(OH)2、-[P(O)(OH)-O]2-H、-[P(O)(OH)-O]2-CH2CH2NH2、-[P(O)(OH)-O]3-CH2CH2NH2、-[P(O)(OH)-O]3-H或-P(O)(OH)-O-CH2CH2NH2。9.根据权利要求6-8中任一项的组合物，其中所述组合物包含摩尔比在1:400至1:1.25范围内的六酰化奈瑟球菌LPS和五酰化奈瑟球菌LPS。10.一种奈瑟球菌属的遗传修饰的细菌，其中所述细菌包括：a)降低或消除由内源lpxL1基因编码的脂质A生物合成月桂酰酰基转移酶活性的遗传修饰；和，b)对所述细菌赋予脂质A生物合成棕榈油酰基酰基转移酶活性的遗传修饰。11.根据权利要求10的遗传修饰的细菌，其中所述细菌是遗传修饰的脑膜炎奈瑟球菌、淋病奈瑟球菌或乳糖奈瑟球菌。12.根据权利要求10或11的遗传修饰的细菌，其中所述内源lpxL1基因是编码LpxL1蛋白的基因，所述LpxL1蛋白具有与SEQIDNO：1-3中的至少一个具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。13.根据权利要求10-12中任一项的遗传修饰的细菌，其中对所述细菌赋予脂质A生物合成棕榈油酰基酰基转移酶活性的遗传修饰是引入异源lpxP基因的表达的遗传修饰，所述异源lpxP基因具有编码与SEQIDNO：4-10中的至少一个具有至少89％的氨基酸序列同一性的LpxP脂质A棕榈油酰基酰基转移酶的核苷酸序列。14.根据权利要求13的遗传修饰的细菌，其中所述核苷酸序列编码已知的冷休克诱导的LpxP棕榈油酰基酰基转移酶，其具有选自SEQIDNO：4-10的氨基酸序列。15.根据权利要求10-14中任一项的遗传修饰的细菌，其中所述细菌被进一步遗传修饰以表达异源抗原。16.根据权利要求15的遗传修饰的细菌，其中所述异源抗原在所述细菌的细胞外外膜表面上表达。17.根据权利要求10-16中任一项的遗传修饰的细菌，其中所述细菌具有降低或消除内源lgtB基因和内源galE基因中的至少一种的表达的遗传修饰。18.根据权利要求10-17中任一项的遗传修饰的细菌，其中所述细菌是脑膜炎奈瑟球菌血清群B，免疫型L3。19.根据权利要求10-18中任一项的遗传修饰的细菌，其中所述细菌是脑膜炎奈瑟球菌菌株H44/76或其衍生物。20.根据权利要求1-5中任一项的六酰化奈瑟球菌LPS、或者根据权利要求6-9中任一项的包含六酰化奈瑟球菌LPS和五酰化奈瑟球菌LPS的混合物的组合物，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：A·扎里里，E·普波埃斯卡洛纳，P·A·范德莱，
申请(专利权)人：由卫生福利和体育大臣代表的荷兰王国，
类型：发明
国别省市：荷兰,NL