大豆核孔蛋白基因GmNup96在调节植物根瘤发育中的应用制造技术

本发明专利技术涉及大豆核孔蛋白基因GmNup96在调节植物根瘤发育中的应用。GmNup96基因序列及其编码蛋白的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1和2所示。本发明专利技术首次通过基因功能试验和验证，沉默大豆核孔蛋白基因GmNup96导致了大豆根瘤数目下降，表明GmNup96基因在根瘤发育和活性调节中发挥重要作用，是大豆中参与结瘤过程的重要基因，可以用于大豆的分子育种等工作。本发明专利技术将为研究大豆核孔蛋白基因在大豆结瘤过程中的作用提供依据，为促进大豆生长发育和提高大豆产量提供新的技术手段。同时，为其它豆科植物根瘤发育调节提供参考。

【技术实现步骤摘要】
大豆核孔蛋白基因GmNup96在调节植物根瘤发育中的应用
本专利技术属于植物基因工程
，具体地说，涉及大豆核孔蛋白基因GmNup96在调节植物根瘤发育中的应用。
技术介绍
细胞核是真核细胞最重要的细胞器(Tamuraetal.2010)。它含有遗传物质，通过调控基因表达来调节细胞活性。在核膜上有核孔复合体(nuclearporecomplex,简称NPC)。这一结构是进入细胞核的唯一通道，介导蛋白质和RNA在细胞质和细胞核之间运输，参与细胞骨架的组成到基因表达等不同的细胞过程(XuandMeier2008；MeierandBrkljacic2009b；D′AngeloandHetzer2008)。在细胞中，核孔复合体是最大的多蛋白复合体且含有大约30个不同的蛋白称为核孔蛋白(Nucleoporin，简称Nup)(Routetal.2000；Cronshawetal.2002)。目前，关于核孔复合体的结构、组成及核孔蛋白功能的研究主要集中在酵母及有限的几个物种(如果蝇、小鼠和人等)中，并已取得了较大的进展(Grossmanetal.2012)，但是，对植物核孔复合体的功能研究和调控机制还有待于进一步阐明(TamuraandHara-Nishimura2013)。大豆核孔蛋白基因的功能及其应用未见报道。通过调节大豆核孔蛋白基因表达来改变根瘤发育和活性的调节也没有报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供大豆核孔蛋白基因GmNup96在调节植物根瘤发育中的应用。为了实现本专利技术目的，第一方面，本专利技术提供大豆核孔蛋白基因GmNup96在调节植物根瘤发育中的应用，其中，GmNup96基因编码的蛋白质为如下(a)或(b)：(a)由SEQIDNO:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)SEQIDNO:2所示序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的由(a)衍生的蛋白质。GmNup96基因(Nup96基因)的核苷酸序列为：i)SEQIDNO:1所示的核苷酸序列；或ii)SEQIDNO:1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且具有相同功能的核苷酸序列；或iii)在严格条件下与SEQIDNO:1所示序列杂交且具有相同功能的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.1％SDS的0.1×SSPE或含0.1％SDS的0.1×SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；或iv)与i)、ii)或iii)的核苷酸序列具有90％以上同源性且具有相同功能的核苷酸序列。本专利技术的大豆核孔蛋白基因GmNup96是采用PCR扩增方法从大豆天隆1号中克隆获得的，使用1对特异性引物进行PCR扩增(SEQIDNO:3-4)：GmNup96.XhoI.F:5′-GTATACTCGAGATGGAATGTGACGTTGGAGGTG-3′GmNup96.EcoRI.R:5′-TGCCTGAATTCCGTAGCAATCTCTGAGAGATA-3′前述的应用，所述调控包括但不限于促进植物根瘤发育，增加根瘤数目。进一步地，所述应用包括：1)使植物包含GmNup96基因；或者，2)使植物过表达GmNup96基因。本专利技术中，所述植物为单子叶植物或双子叶植物，优选大豆或拟南芥。第二方面，本专利技术提供大豆核孔蛋白基因GmNup96在植物育种中的应用。其中，育种目的包括但不限于促进植物根瘤发育，增加根瘤数目。第三方面，本专利技术提供一种减少大豆根瘤数目的方法，通过基因工程手段，对大豆核孔蛋白基因GmNup96进行定点突变，使得该基因功能缺失或减弱，从而减少大豆根瘤数目；或者通过向大豆中导入抑制子来沉默GmNup96基因，从而减少大豆根瘤数目。其中，所述抑制子包括但不限于shRNA、siRNA、dsRNA、miRNA、cDNA、反义RNA/DNA；优选地，利用RNA干扰(RNAinterference,简称RNAi)的方法使大豆核孔蛋白基因GmNup96的mRNA表达水平降低，从而减少大豆根瘤数目。更优选地，所述抑制子是由引物GmNup96RNAi-F和GmNup96RNAi-R对应的GmNup96基因上的靶DNA片段编码的RNA，其中所述引物GmNup96RNAi-F和GmNup96RNAi-R的序列如下(SEQIDNO:5-6)：GmNup96RNAi-F:5′-TCAAGAATGGCAGGCGAGAT-3′GmNup96RNAi-R:5′-GGAATGGGAGCACTGAAAGC-3′此外，本专利技术提供含有所述GmNup96基因的生物材料，所述生物材料包括但不限于表达盒、表达载体、克隆载体、工程菌或非可再生的植物部分。携带有所述目的基因的表达载体可通过使用Ti质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞中(Weissbach，1998，MethodforPlantMolecularBiologyVIII，AcademyPress，NewYork，第411-463页；Geiserson和Corey，1998，PlantMolecularBiology，2ndEdition)。本专利技术还提供所述GmNup96基因在制备转基因植物中的应用。借由上述技术方案，本专利技术至少具有下列优点及有益效果：本专利技术首次通过基因功能试验和验证，沉默大豆核孔蛋白基因GmNup96导致了大豆根瘤数目下降，表明GmNup96基因在根瘤发育和活性调节中发挥重要作用，是大豆中参与结瘤过程的重要基因，可以用于大豆的分子育种等工作。本专利技术将为研究大豆核孔蛋白基因在大豆结瘤过程中的作用提供依据，为促进大豆生长发育和提高大豆产量提供新的技术手段。进一步地，利用35S启动子驱动GmNup96-GFP融合蛋白在拟南芥中过表达，结果表明GmNup96定位在核膜上。采用RNAi技术，获得GmNup96-RNAi转基因大豆植株，经检测，转基因大豆植株中GmNup96mRNA水平下降；接种根瘤后，根瘤数目可明显减少。因而，调节大豆核孔蛋白基因GmNup96mRNA表达水平可改变根瘤发育及其活性，为其它豆科植物根瘤发育调节提供参考。附图说明图1为本专利技术实施例1中大豆核孔蛋白基因GmNup96的PCR扩增引物的琼脂糖凝胶电泳结果。图中右边的泳道在3000bp和5000bp之间可见一条特异的目的条带。图2为本专利技术实施例1中入门载体GEC的结构示意图。图3为本专利技术实施例1中GmNup96基因表达模式分析。图4为本专利技术实施例2中植物表达载体BDV2的结构示意图。图5为本专利技术实施例2中大豆核孔蛋白GmNup96的亚细胞定位。标尺＝50μm。图6为本专利技术实施例3中pGWCm入门载体的结构示意图。图7为本专利技术实施例3中植物RNAi表达载体pB7GWIWG2的结构示意图。图8为本专利技术实施例3中GmNup96-RNAi转基因植株分子检测。其中，WT表示野生型；P表示阳性质粒；#2、#3-1、#3-2、#8、#9表示获得的不同的转基因大豆株系；M表示DL5000DNAMarker。图9为本专利技术实施例3中GmNup96-RNAi转基因植株GmNup96mRNA表达水平。其中，WT表示野生型；#2、#3、#8、#9表示获得的不同的GmNup96-RNAi转基因大豆株系。图10为本专利技术实施例4中本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.大豆核孔蛋白基因GmNup96在调节植物根瘤发育中的应用，其中，GmNup96基因编码的蛋白质为如下(a)或(b)：(a)由SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)SEQ ID NO:2所示序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的由(a)衍生的蛋白质。

【技术特征摘要】
1.大豆核孔蛋白基因GmNup96在调节植物根瘤发育中的应用，其中，GmNup96基因编码的蛋白质为如下(a)或(b)：(a)由SEQIDNO:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)SEQIDNO:2所示序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的由(a)衍生的蛋白质。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述调控包括促进植物根瘤发育，增加根瘤数目。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用包括：1)使植物包含GmNup96基因；或者，2)使植物过表达GmNup96基因。4.根据权利要求1-3任一项所述的应用，其特征在于，所述植物为单子叶植物或双子叶植物，优选大豆或拟南芥。5.大豆核孔蛋白基因GmNup96在植物育种中的应用，其中，所述GmNup96基因的定义同权利要求1中所述。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，育种目的包括促进植物根瘤发育，增加根瘤数目。7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述植物为单子叶植...

【专利技术属性】
技术研发人员：傅永福，陈福禄，董秀春，黄鹏辉，纪丹丹，
申请(专利权)人：中国农业科学院作物科学研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11