一种CST1化学发光检测试剂盒及其检测方法技术

本发明专利技术涉及一种CST1化学发光检测试剂盒及其检测方法，属于免疫诊断领域，其试剂盒包括链霉亲和素偶联磁珠、生物素标记的捕获抗体、吖啶酯标记的检测抗体、预激发液和激发液以及洗涤浓缩液；本发明专利技术检测试剂盒利用磁分离以及吖啶酯直接化学发光检测法的优势，使检测过程简单、易于操作、便于自动化；同时本发明专利技术使用的单抗作为捕获抗体和检测抗体，使得试剂盒还具有灵敏度高、特异性好、检测限低及稳定性好等特性，线性范围达到6.25～1600U/mL，最低检测限可达1.5U/mL，能够用于检测CST1蛋白过量表达或诊断以CST1蛋白异常表达为表征的疾病的产品的应用。

【技术实现步骤摘要】
一种CST1化学发光检测试剂盒及其检测方法
本专利技术属于免疫诊断领域，涉及一种CST1化学发光检测试剂盒，还涉及利用该试剂盒的检测方法。
技术介绍
半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN(CST1)是人类半胱氨酸蛋白酶抑制剂家族成员，由CST1基因编码的含141个氨基酸的蛋白质，分子量为16.4Kda。CST1分子中含有两个二硫键，为典型的分泌蛋白，分布于体液和分泌物中，如眼泪、唾液、血清、血浆等。随着对肿瘤发病机理研究的不断深入，发现CST1作为组织蛋白酶是半胱氨酸蛋白酶的内源性抑制剂家族成员之一，在肿瘤的发生、发展、浸润和转移过程中起着非常重要的作用。研究结果显示，半胱氨酸蛋白酶抑制剂家族成员在不同肿瘤中的表达水平有所上升，例如CystatinC在卵巢癌和头颈部癌症中的表达有不同水平的上升，CystatinA在非小细胞肺癌中的表达水平有所增加。据报道CST1能够用于食管癌、肺癌、乳腺癌中均有异常表达。CST1的定量检测具有重要的临床意义。目前样本中CST1的检测方法主要为酶联免疫法，酶联免疫法存在着操作繁琐、检测时间长、自动化程度低、受人为因素影响较大等诸多弊端；且现有CST1检测体系中多采用多克隆抗体；抗体特异性差，不能区分CST1高度同源家族蛋白，由于其抗体本身效价或特异性的原因，也使得其对CST1检测的临床效用受到局限，降低了样本检测的特异性，同时也对灵敏度产生一定的影响。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的之一在于提供一种CST1化学发光检测试剂盒；本专利技术的目的之二在于提供利用所述的CST1化学发光检测试剂盒的检测方法。为达到上述目的，本专利技术提供如下技术方案：1.一种CST1化学发光检测试剂盒，包括包被有捕获抗体的化学发光板、辣根过氧化物酶标记的检测抗体、底物液以及洗涤浓缩液，所述捕获抗体为杂交瘤细胞株4G2分泌的单克隆抗体，所述检测抗体为杂交瘤细胞株4E7分泌的单克隆抗体，所述杂交瘤细胞株4G2保藏号为CGMCCNo.15199，杂交瘤细胞株4E7保藏号为CGMCCNO.15198。优选的，所述洗涤浓缩液为含有吐温20的磷酸盐缓冲液，所述吐温20的体积分数为0.5-3％，洗涤浓缩液的pH为7.0-7.8。优选的，所述化学发光板上捕获抗体的包被量为100μL，浓度为1-5μg/ml。优选的，所述辣根过氧化物酶标记的检测抗体用量为100μl，浓度为1-500ng/ml。更优选的，还包括校准品，所述校准品为CST1蛋白溶液。本专利技术中，所述化学发光底物液为所述化学发光底物液为含辣根过氧化物酶发光底物的溶液。2、利用所述的CST1化学发光检测试剂盒的检测方法，包括以下步骤：(1)取出试剂盒和血清样品，18～25℃平衡15-30min，并稀释洗涤浓缩液至工作浓度；(2)取出包被有捕获抗体的化学发光板，每孔加入100μL校准品和血清样品，37℃孵育60min；(3)甩干孔内混合物，用洗涤液注满各孔，静置20秒，甩干孔内液体，重复5次，最后拍干；(4)每孔分别加入辣根过氧化物酶标记的检测抗体100μl，37℃孵育60min；(5)甩干孔内混合物，用洗涤液注满各孔，静置20秒，甩干孔内液体，重复5次，最后拍干；(6)每孔加入化学发光底物100μL，反应并测定各孔发光强度；(7)根据校准品浓度与光强度绘制校准曲线，样本光强度在校准曲线上相对应的浓度值即为待测样品的测定浓度。本专利技术的有益效果在于：(1)本专利技术采用的捕获抗体和检测抗体均为特异性单克隆抗体，较多克隆抗体和其它单克隆抗体相比，试剂盒的灵敏度和特异性均有很大程度的的改善；(2)本专利技术试剂盒线性范围达到6.25～1600U/mL，最低检测限可达3U/mL。本试剂盒检测食管癌样本，在特异性85％时，灵敏度可达到80％。CST1定量检测试剂盒能够用于食管癌的早期诊断、治疗过程中的疗效评估以及治疗后的转移复发监控。附图说明为了使本专利技术的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本专利技术提供如下附图进行说明：图1为重组CST1蛋白SDS-PAGE电泳图。图2为4G2和4E7抗体SDS-PAGE电泳图。图3为CST1截断蛋白免疫印迹WB检测结果。图4是CST1校准曲线，其中，Y轴代表发光值对数值，X轴代表CST1校准品的浓度对数值。图5是CST1化学发光检测试剂盒检测食管癌的ROC曲线。生物保藏本专利技术中杂交瘤细胞株4G2和4E7，于2017年12月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，杂交瘤细胞株4G2保藏号为CGMCCNo.15199，杂交瘤细胞株4E7保藏号为CGMCCNo.15198，分类命名为杂交瘤细胞株4G2和杂交瘤细胞株4E7。具体实施方式以下结合具体实施例对本专利技术做进一步详细说明，应理解，以下实施例仅用于说明本专利技术而非用于限定本专利技术的范围。实施例1、CST1的重组蛋白表达和纯化从食管癌癌组织提取RNA后经随机引物RT-PCR得到的cDNA为模板，设计引物进行CST1基因的克隆，引物具体为：CST1-F：5’-cccaagcttgccaccatggcccagtatctgagtacc-3’)(SEQIDNO.1)；CST1-R：5’-ggattcttgacacctggatttcac-3’(SEQIDNO.2)。扩增的CST1基因插入到含有6×His标签的pcDNA3.1载体上，得CST1-pcDNA3.1。然后将CST1-pcDNA3.1转化至DH5α，挑取阳性克隆并大量培养后，用高纯度质粒提取试剂盒提取重组质粒CST1-pcDNA3.1。重组质粒转入293T细胞中，并同时转染pcDNA3.1空载体作为阴性对照，分别在含10％胎牛血清的DMEM培养基在37℃、5％CO2条件下培养72h，收集上清，利用0.22μm滤膜过滤上清液。将所得500mL滤液进行非变性条件下的Ni-NTA亲和层析，平衡缓冲液为50mMPBS、10mM咪唑、150mMNaCl，pH7.6。上样完毕后，清洗10mL；用50mMPBS250mM咪唑、150mMNaCl，pH7.6洗脱，收集洗脱液。利用3kD超滤管浓缩蛋白溶液，将蛋白保存于pH7.450mMPBS缓冲液中，-80℃保存。纯化的蛋白进行SDS-PAGE电泳纯度鉴定，分子量大小在15kD左右，灰度分析表明蛋白纯度达到95％以上，见图1。实施例2、CST1单克隆抗体杂交瘤细胞株的制备小鼠免疫：用CST1蛋白免疫3批BALB/c小鼠，每次3只。每只小鼠每次免疫50μg抗原。首次免疫CST1抗原与弗氏完全佐剂1:1混合，随后CST1与弗氏不完全完全佐剂1:1混合，每隔两周免疫一次，共免疫3次，第三次免疫十天后断尾采血，检测血清效价。杂交瘤细胞融合：检测小鼠血清效价达到1:100000后用CST1抗原(不含佐剂)腹腔加强免疫(30μg)，3天后无菌取免疫小鼠的脾细胞与SP2/0小鼠骨髓瘤细胞大约按4:1比例混合在50mL离心管，用培养基洗涤两次后弃上清，然后加入1mL预热50％PEG-1450作用1min后，水浴中缓缓摇动90s，立即缓慢滴加37℃预热的无血清DMEM培养基15mL，37℃水浴5min，然后补加无血清DMEM培养基至40mL，1000rpm/mim离本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种CST1化学发光检测试剂盒，其特征在于：包括包被有捕获抗体的化学发光板、辣根过氧化物酶标记的检测抗体、化学发光底物液以及洗涤浓缩液，所述捕获抗体为杂交瘤细胞株4G2分泌的单克隆抗体，所述检测抗体为杂交瘤细胞株4E7分泌的单克隆抗体，所述杂交瘤细胞株4G2保藏号为CGMCC No.15199，杂交瘤细胞株4E7保藏号为CGMCC NO.15198。

【技术特征摘要】
1.一种CST1化学发光检测试剂盒，其特征在于：包括包被有捕获抗体的化学发光板、辣根过氧化物酶标记的检测抗体、化学发光底物液以及洗涤浓缩液，所述捕获抗体为杂交瘤细胞株4G2分泌的单克隆抗体，所述检测抗体为杂交瘤细胞株4E7分泌的单克隆抗体，所述杂交瘤细胞株4G2保藏号为CGMCCNo.15199，杂交瘤细胞株4E7保藏号为CGMCCNO.15198。2.根据权利要求1所述CST1化学发光检测试剂盒，其特征在于：所述洗涤浓缩液为含有吐温20的磷酸盐缓冲液，所述吐温20的体积分数为0.5-3％，洗涤浓缩液的pH为7.0-7.8。3.根据权利要求1所述CST1化学发光检测试剂盒，其特征在于：所述化学发光板上捕获抗体的包被量为100μL，浓度为1-5μg/ml。4.根据权利要求1所述CST1化学发光检测试剂盒，其特征在于：所述辣根过氧化物酶标记的检测抗体用量为100μl，浓度为1-500ng/ml。5.根据权利要求1所述CST1化学发光检测试剂盒，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：王力军，孙玉龙，杨亚云，何林富，王义，
申请(专利权)人：上海良润生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31