一种胶乳增强免疫透射比浊检测方法技术

本发明专利技术涉及一种胶乳增强免疫透射比浊检测方法，将待测样品和多个不同浓度的标准品分别加入酶标仪的孔板的不同微孔中，然后在各个所述的微孔中先后加入R1试剂和R2试剂，将所述的孔板放入所述的酶标仪中进行检测；其中，所述的待测样品或所述的标准品、所述的R1试剂、所述的R2试剂的投料体积比为1：10~20：20~30，所述的R1试剂包含表面活性剂，所述的R2试剂包含偶联有抗体的胶乳微球。本发明专利技术采用酶标仪检测免疫颗粒复合物的吸光值，一次可以检测多达96个标本，测定速度快，操作方便，所需试剂量小，设备成本低，普及率高，易于实现高能量检测，适合于一般的医疗机构和不发达地区使用。

【技术实现步骤摘要】
一种胶乳增强免疫透射比浊检测方法
本专利技术涉及一种胶乳增强免疫透射比浊检测方法。
技术介绍
胶乳颗粒增强比浊法（Latexparticle-enhancedturbidimetricimmunoassay,LETIA）是近年来出现的一种较为稳定、准确的体液蛋白均相免疫比浊检测方法。LETIA法通过在高分子乳胶微球表面交联的单克隆抗体，而当抗原与交联有抗体的微球结合后，能够在短时间内迅速聚集在一起，改变反应溶液的吸光度。而且，反应液吸光度的改变与被测抗原的浓度在一定范围内具有线性关系，可用来反映被测抗原的浓度。此方法相对于其他常用的体液蛋白检测方法有很多优势:LETIA省却了酶联免疫吸附测定（Enzyme-LinkedImmunosorbentAssay，ELISA）法反复孵育和洗板等烦琐操作步骤，几分钟就能获得结果，并且稳定性和重复性都较好，能较真实地反映被测物质的含量；相对胶体金层析法（俗称“金标”）具有更高的灵敏度，可用于定量检测；相比于放射免疫测定（Radioimmunoassay，RIA），则具有更好的稳定性，以及能够避免发射性污染等优点。目前，LETIA检测试剂所采用的乳胶颗粒多为惰性微球、羧基化微球及氨基化微球。加入氨基或者羧基等修饰的功能性微球，与抗体通过共价键的形式结合，提高与抗体结合率的同时也为抗体提供了合适的3D结构与抗原进行结合，提升了检测的敏感性和特异性。由于纳米级粒子尺寸属于原子簇和宏观体系的过度区域，具有高比表面积的特性，它的应用加快达到吸附平衡的时间和吸附平衡的稳定性，提高了反应速度和结果的稳定性。LETIA相对传统的免疫比浊方法，解决了对抗体结合的能力不强、临床检测的线性范围窄、干扰因素多、实验稳定性差等问题，大大促进了免疫比浊法在临床上的广泛应用。胶乳增强浊度的免疫透射比浊大大提高了检测的灵敏度，有广阔的应用前景。现有技术方案使用的试剂通常为双试剂，包含R1和R2两种试剂。R1成份为包含表面活性剂的缓冲溶液；R2的主要成份为胱抑素C抗体-胶乳微球复合物。检测使用的样品为无溶血的新鲜血清。现有技术方案1：(1）在特定缓冲液体系中加入一定量的表面活性剂，制得R1试剂。将抗人胱抑素C抗体通过化学耦联的方法结合到胶乳微球的表面，形成胱抑素C抗体-胶乳微球复合物，加入适量防腐剂等得到R2试剂。）将己知浓度的胱抑素C标准品作倍比稀释，得到浓度为原浓度1/6，1/3，1/2，2/3，5/6和原倍的6个标准品。）将（2）中6个标准品分别先后按比例与R1和R2试剂混合，在恒温、震荡条件下充分反应，生成不溶性免疫复合物。）用分光光度仪在546nm波长处检测免疫复合物的吸光值。）以六个标准品的浓度为横坐标，相应的吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。）将待测血清样本先后按比例与R1和R2试剂混合，在恒温、震荡条件下充分反应，生成不溶性免疫复合物，在分光光度仪上检测该免疫复合物吸光值，通过标准曲线求血清样本中胱抑素C的浓度。现有技术方案2：(1）在特定缓冲液体系中加入一定量的表面活性剂，制得R1试剂。将抗人胱抑素C抗体通过化学耦联的方法结合到胶乳微球的表面，形成胱抑素C抗体-胶乳微球复合物，加入适量防腐剂等得到R2试剂。）将己知浓度的胱抑素C标准品作倍比稀释，得到浓度为原浓度1/6，1/3，1/2，2/3，5/6和原倍的6个标准品。）在全自动生化分析仪（以日立7170为例）上按以下条件设定参数：两点终点法；测定温度：37℃；比色杯光径1.0cm；波长546nm（主）；样品量：3.0ul；试剂R1：240ul；试剂R2：60ul；测光点：16-34；上升反应。）将（2）中6个标准品和待测样品放入生化分析仪的样品杯中。启动全自动生化仪，执行定标和检测程序。）全自动生化仪自动给出检测结果。目前，对免疫颗粒复合物浊度检测的仪器主要是分光光度计和全自动（半自动〕生化分析仪，分光光度计每次只能检测一个样本，而且每次检测完后要清洗比色池，操作烦琐，误差大。生化分析仪操作方便，准确度高，但生化分析仪价格昂贵，维护使用复杂，且每次检测所需试剂量大，检测成本高。公开了一种复合胶乳粒子包被胱抑素C检测试剂盒，包括R1试剂、R2试剂及校准品，R1试剂为磷酸盐缓冲体系，其组分为pH值为7.2~7.6的磷酸盐缓冲液30~60mmol/L、分子量为6000~8000的聚乙二醇60~95mmol/L、乙二胺四乙酸二钠6~13mmol/L。R2试剂包括羊抗人胱抑素C多克隆抗体包被的两种大小不同的聚苯乙烯胶乳粒子致敏颗粒；还包括乳胶稀释液以及封闭液。但是，该专利采用的检测设备也为全自动生化仪。公开了一种胱抑素C检测试剂盒及其制备方法，其包括试剂R1、试剂R2及校准品，试剂R1的组分为：Tris缓冲液0.01~0.05mol/L,PEG600010~40g/L，NaN30.5~1.5g/L，氯化钠10~20g/L，pH值8.0~8.5。R2试剂的组分为：Tris缓冲液0.01~0.02mol/L，羊抗人胱抑素C多克隆抗体包被的聚苯乙烯胶乳颗粒0.5~3g/L。但是，该专利采用的检测设备也为全自动生化仪。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种能够使用酶标仪进行检测的胶乳增强免疫透射比浊检测方法。为解决以上技术问题，本专利技术采取如下技术方案：本专利技术的一个目的是提供一种胶乳增强免疫透射比浊检测方法，将待测样品和多个不同浓度的标准品分别加入酶标仪的孔板的不同微孔中，然后在各个所述的微孔中先后加入R1试剂和R2试剂，将所述的孔板放入所述的酶标仪中进行检测；其中，所述的待测样品、所述的R1试剂、所述的R2试剂的投料体积比为1：10~20：20~30，所述的标准品、所述的R1试剂、所述的R2试剂的投料体积比为1：10~20：20~30，所述的R1试剂包含表面活性剂，所述的R2试剂包含偶联有抗体的胶乳微球。优选地，所述的待测样品、所述的R1试剂、所述的R2试剂的投料体积比为1：13~17：23~27，所述的标准品、所述的R1试剂、所述的R2试剂的投料体积比为1：13~17：23~27。优选地，所述的待测样品或所述的标准品的投料体积为2~8微升。进一步优选地，所述的待测样品或所述的标准品的投料体积为3~6微升。优选地，所述的胶乳微球为纳米级的聚苯乙烯胶乳微球。进一步优选地，所述的胶乳微球的平均粒径为50~150nm。优选地，所述的偶联有抗体的胶乳微球的制备方法为将所述的胶乳微球用缓冲液稀释后，采用EDC活化，经清洗后，加入抗体进行偶联使得所述的抗体结合到所述的胶乳微球的表面制得所述的偶联有抗体的胶乳微球。进一步优选地，制备所述的偶联有抗体的胶乳微球时的缓冲液为磷酸缓冲液或Tris。进一步优选地，制备所述的偶联有抗体的胶乳微球时，所述的胶乳微球与所述的缓冲液的投料质量比为1：100~150。进一步优选地，制备所述的偶联有抗体的胶乳微球时，所述的胶乳微球与所述的EDC的投料质量比为1.5~2：1。进一步优选地，制备所述的偶联有抗体的胶乳微球时，采用磷酸缓冲液或Tris进行所述的清洗。进一步优选地，制备所述的偶联有抗体的胶乳微球时，所述的胶乳微球与所述的抗体的投料质量比为1：1~5。优选地，所述的抗体包括但不限于抗人胱抑素C抗体、C反应蛋白抗本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种胶乳增强免疫透射比浊检测方法，其特征在于：将待测样品和多个不同浓度的标准品分别加入酶标仪的孔板的不同微孔中，然后在各个所述的微孔中先后加入R1试剂和R2试剂，将所述的孔板放入所述的酶标仪中进行检测；其中，所述的待测样品、所述的R1试剂、所述的R2试剂的投料体积比为1：10~20：20~30，所述的标准品、所述的R1试剂、所述的R2试剂的投料体积比为1：10~20：20~30，所述的R1试剂包含表面活性剂，所述的R2试剂包含偶联有抗体的胶乳微球。

【技术特征摘要】
1.一种胶乳增强免疫透射比浊检测方法，其特征在于：将待测样品和多个不同浓度的标准品分别加入酶标仪的孔板的不同微孔中，然后在各个所述的微孔中先后加入R1试剂和R2试剂，将所述的孔板放入所述的酶标仪中进行检测；其中，所述的待测样品、所述的R1试剂、所述的R2试剂的投料体积比为1：10~20：20~30，所述的标准品、所述的R1试剂、所述的R2试剂的投料体积比为1：10~20：20~30，所述的R1试剂包含表面活性剂，所述的R2试剂包含偶联有抗体的胶乳微球。2.根据权利要求1所述的胶乳增强免疫透射比浊检测方法，其特征在于：所述的待测样品、所述的R1试剂、所述的R2试剂的投料体积比为1：13~17：23~27，所述的标准品、所述的R1试剂、所述的R2试剂的投料体积比为1：13~17：23~27。3.根据权利要求1或2所述的胶乳增强免疫透射比浊检测方法，其特征在于：所述的待测样品或所述的标准品的投料体积为2~8微升。4.根据权利要求3所述的胶乳增强免疫透射比浊检测方法，其特征在于：所述的待测样品或所述的标准品的投料体积为3~6微升。5.根据权利要求1所述的胶乳增强免疫透射比浊检测方法，其特征在于：所述的胶乳微球为纳米级的聚苯乙烯胶乳微球。6.根据权利要求1或5所述的胶乳增强免疫透射比浊检测方法，其特征在于：所述的偶联有抗体的胶乳微球的制备方法为将所述的胶乳微球用缓冲液稀释后，采用EDC活化，经清洗后，加入抗体进行偶联使得所述的抗体结合到所述的胶乳微球的表面制得所述的偶联有抗体的胶乳微球。7.根据权利要求1所述的胶乳增强免疫透射比浊检测方法，其特征在于：所述的抗体...

【专利技术属性】
技术研发人员：何爱民，
申请(专利权)人：光景生物科技苏州有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32