一种改善记忆功能的核桃活性肽及其制备方法技术

一种改善记忆功能的核桃活性肽的制备方法，属于活性肽制备技术领域。以脱脂核桃粕为原料，经粉碎均质后，通过碱性蛋白酶和中性蛋白酶两步控制酶解技术充分水解，并采用膜分离技术，得到分子量﹥10kDa、10kDa～3kDa及﹤3kDa三个组分多肽。本发明专利技术所述技术，在两种酶共同作用下获得高水解度、高活性的核桃肽。分别以小鼠Morris水迷宫中空间探索试验和定位航行试验、避暗试验和跳台试验等行为学试验为指标，评价本发明专利技术物对实验动物改善记忆力的影响。结果显示，肽链较短的小肽(＜3kDa)对记忆障碍小鼠的空间认知及学习能力具有改善作用，并为食源性肽，具有安全性高，可长期服用。

【技术实现步骤摘要】
一种改善记忆功能的核桃活性肽及其制备方法
本专利技术属于活性肽制备
，具体涉及一种以脱脂核桃粕为原料制备的具有明显改善记忆功能的核桃活性肽及其制备方法。
技术介绍
随着全球人口老龄化的增加，与记忆力障碍密切相关的帕金森病(Parkinson'sdisease，PD)、阿尔滋海默病(Alzheimer'sdisease，AD)等一系列神经退行性疾病的发病率逐年递增，给家庭和社会带来了沉重的负担。目前，记忆衰退患者的主要治疗药物为盐酸多奈哌奇和吡啦西坦等化学合成类药物，虽然可以改善患者空间学习和记忆认知能力，但同时会产生一些不良反应，如幻觉、易激怒和攻击行为的精神紊乱。因此开发和使用天然来源改善记忆力的药物显得尤为重要。近年来，食源性植物蛋白的开发与利用成为人们关注的热点，利用酶工程技术获得的蛋白肽更是具有抗衰老、抗氧化、改善记忆力、消除疲劳、增强人体免疫功能等生理功能。核桃仁是一种优质的植物蛋白，蛋白含量高达20％，蛋白质中氨基酸含量丰富，且必需氨基酸种类齐全。利用酶控制水解技术，制备具有抗氧化和改善记忆力的生物活性肽，用以预防和治疗氧化及自由基损伤引发的记忆力障碍等疾病具有很好的现实意义。
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种具有明显改善记忆功能的核桃活性肽及其制备方法，以脱脂核桃粕为原料，采用复合酶控制水解技术，通过分离纯化，制备得到具有明显改善记忆的核桃活性肽。本专利技术所述的一种改善记忆功能的核桃活性肽的制备方法，其步骤如下：(1)核桃脱脂蛋白粉制备取脱脂核桃粕50～250g，经多功能粉碎机粉碎30～90s后，与蒸馏水按照质量比1：5～10的比例混合，经胶体磨均质30～90s，静止3～8h，去掉部分上清液后，于3000～8000rpm离心10～20min；留沉淀，于-50℃、＜30Pa条件下冷冻干燥20～30h，得到核桃脱脂蛋白粉；(2)核桃活性肽粗粉的制备将步骤(1)制备的核桃脱脂蛋白粉与蒸馏水配制成质量分数2％～7％溶液，在90～100℃条件下恒温水浴10～20min，冷却至40℃～60℃后，用1mol/LNaOH调节溶液pH至7.5～9.5；保持pH值恒定，加入碱性蛋白酶Alcalase2.4L，加酶量为1000U/g～9000U/g，酶解0.5～5h后，溶液在90℃下灭酶10～20min；最后冷却至40℃～60℃，用1mol/LNaOH调节溶液pH至6.5～7.5；保持pH值恒定，加入中性蛋白酶Neutrase0.8L，加酶量为1000U/g～11000U/g，酶解0.5～5h后，90℃灭酶10～20min；5000～8000rpm离心10～20min，上清液冷冻干燥后得到核桃活性肽粗粉；加入中性蛋白酶和加入碱性蛋白酶，加酶量均是按照核桃脱脂蛋白粉进行计算；(3)核桃活性肽粗提物的分离纯化将步骤(2)得到的核桃活性肽粗粉用蒸馏水配成浓度1～5mg/mL的溶液，利用超滤膜进行分离；将得到的溶液收集，旋转蒸发后-20℃冷冻后，于-50℃、＜30Pa条件下冷冻干燥20～30h，得到本专利技术所述的具有改善记忆的核桃活性肽。步骤(3)中所述的超滤膜为切向流超滤系统及Biomax改良聚醚砜复合膜包，分别采用膜分子截流量为10kDa和3kDa的超滤膜进行分离；先用分子截流量为10kDa的膜包过膜，得出>10kDa和＜10kDa两个不同分子量组分的核桃活性肽；再将＜10kDa分子量组分的核桃活性肽粗液用分子截流量为3kDa的膜包过膜，得到3～10kDa和＜3kDa两个不同分子量组分的核桃活性肽，这样经过10kDa和3kDa的超滤膜就可以最终得到分子量＜3kDa的活性肽。本专利技术相比现有技术优点为：本专利技术首次公开了一种改善记忆功能的核桃活性肽的制备方法，利用脱脂核桃粕为原料，经粉碎均质后，通过碱性蛋白酶和中性蛋白酶两步控制酶解技术充分水解，并采用膜分离技术，得到﹥10kDa、10kDa～3kDa及﹤3kDa三个组分多肽，本专利技术公布的复合酶控制水解技术，在其共同作用下获得高水解度，高活性肽。按照《保健食品检验与评价规范》对其进行功效实验，分别以小鼠Morris水迷宫中空间探索试验和定位航行试验、避暗试验和跳台试验等行为学试验为指标，评价本专利技术物对实验动物改善记忆力的影响。结果显示，肽链较短的小肽(＜3kDa)对记忆障碍小鼠的空间认知及学习能力具有改善作用，并为食源性肽，具有安全性高，可长期服用。本专利技术属于活性肽制备
附图说明图1：为小鼠定位航行试验路径图；图中黑色框为计算机探头所监测的包括泳池在内的实验区域，黑色大圆圈为泳池，黑色小圆圈和在小圆圈与大圆圈中间的圆圈为计算机自动将泳池平均分成三等分，其中“十字”将泳池划分为四个象限，右上区域为NE象限，右下区域为SE象限，左上区域为NW象限，左下区域为SW象限。图1为将小鼠在SW象限面向池壁放入水中，直径为8cm，高为20～35cm的圆形平台放在NE象限，杂乱曲线轨迹为小鼠在泳池内寻找平台的游走路线。图2：为小鼠空间探索试验路径图；图中黑色框为计算机探头所监测的包括泳池在内的实验区域，黑色大圆圈为泳池，黑色小圆圈和在小圆圈与大圆圈中间的圆圈为计算机自动将泳池平均分成三等分，其中“十字”将泳池划分为四个象限，右上区域为NE象限，右下区域为SE象限，左上区域为NW象限，左下区域为SW象限。图2为将小鼠在SW象限面向池壁放入水中，将原来放在NE象限的直径为8cm，高为20～35cm的圆形平台移走，观察小鼠在60s内穿过原平台的次数，杂乱曲线为小鼠在泳池内寻找原平台的游走路线。图3：为核桃活性肽对小鼠避暗错误次数的影响柱形图；图4：为核桃活性肽对小鼠避暗反应试验中潜伏期的影响柱形图；图5：为核桃活性肽对小鼠跳台错误次数的影响柱形图；图6：为核桃活性肽对小鼠跳台试验中潜伏期的影响柱形图。具体实施方式以下结合实施例来进一步解释本专利技术，但实施例并不对本专利技术作任何限定。实施例1：(1)核桃脱脂蛋白粉制备取脱脂核桃粕50g经多功能粉碎机粉碎40s，与蒸馏水按照料液比1：6(质量)混合，用胶体磨均质60s后，静止8h，去掉上清液后，5000rpm离心10min，取沉淀物，与-20℃冷冻后，于-50℃、25Pa条件下冷冻干燥24h，即得核桃脱脂蛋白粉。(2)核桃活性肽制备将5g核桃脱脂蛋白粉溶于100mL蒸馏水配制成质量分数5％的溶液，90℃水浴10min，用1.0mol/LNaOH调节溶液pH＝8，冷却至40℃；保持pH值恒定，加入碱性蛋白酶Alcalase2.4L，加酶量7000U/g，40℃下酶解3h后，溶液在90℃下灭酶10min；冷却至40℃，用1.0mol/LNaOH调节溶液pH至7.0；保持pH值恒定，加入Neutrase0.8L中性蛋白酶，加酶量8000U/g，55℃酶解2.5h后，溶液在90℃下灭酶10min；冷却至室温，5000rpm离心10min，上清液冷冻干燥后得到核桃活性肽粗粉。(3)核桃活性肽粗提物的分离纯化将核桃活性肽粗粉溶于蒸馏水中配成2mg/mL的溶液，分别采用膜分子截流量为10kDa和3kDa的超滤膜进行分离。将得到的分子量＜3kDa溶液收集，经旋转蒸发后在-50℃、25Pa条件下冷冻干燥24h，即为本专利技术所述的分子量＜3本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种改善记忆功能的核桃活性肽的制备方法，其步骤如下：(1)核桃脱脂蛋白粉制备取脱脂核桃粕50～250g，经多功能粉碎机粉碎30～90s后，与蒸馏水按照质量比1：5～10的比例混合，经胶体磨均质30～90s，静止3～8h，去掉部分上清液后，于3000～8000rpm离心10～20min；留沉淀，于‑50℃、＜30Pa条件下冷冻干燥20～30h，得到核桃脱脂蛋白粉；(2)核桃活性肽粗粉的制备将步骤(1)制备的核桃脱脂蛋白粉与蒸馏水配制成质量分数2％～7％溶液，在90～100℃条件下恒温水浴10～20min，冷却至40℃～60℃后，用1.0mol/L NaOH调节溶液pH至7.5～9.5，保持pH值恒定，加入碱性蛋白酶Alcalase 2.4L，加酶量为1000U/g～9000U/g，酶解0.5～5h后，溶液在90℃下灭酶10～20min；最后冷却至40℃～60℃，用1.0mol/L NaOH调节调节溶液pH至6.5～7.5；保持pH值恒定，加入中性蛋白酶Neutrase 0.8L，加酶量为1000U/g～11000U/g，酶解0.5～5h后，90℃灭酶10～20min；5000～8000rpm离心10～20min，上清液冷冻干燥后得到核桃活性肽粗粉；加入中性蛋白酶和加入碱性蛋白酶，加酶量均是按照核桃脱脂蛋白粉进行计算；(3)核桃活性肽粗提物的分离纯化将步骤(2)得到的核桃活性肽粗粉用蒸馏水配成浓度1～5mg/mL的溶液，利用超滤膜进行分离；将得到的溶液收集，旋转蒸发后‑20℃冷冻后，于‑50℃、＜30Pa条件下冷冻干燥20～30h，得到具有改善记忆功能的核桃活性肽。...

【技术特征摘要】
1.一种改善记忆功能的核桃活性肽的制备方法，其步骤如下：(1)核桃脱脂蛋白粉制备取脱脂核桃粕50～250g，经多功能粉碎机粉碎30～90s后，与蒸馏水按照质量比1：5～10的比例混合，经胶体磨均质30～90s，静止3～8h，去掉部分上清液后，于3000～8000rpm离心10～20min；留沉淀，于-50℃、＜30Pa条件下冷冻干燥20～30h，得到核桃脱脂蛋白粉；(2)核桃活性肽粗粉的制备将步骤(1)制备的核桃脱脂蛋白粉与蒸馏水配制成质量分数2％～7％溶液，在90～100℃条件下恒温水浴10～20min，冷却至40℃～60℃后，用1.0mol/LNaOH调节溶液pH至7.5～9.5，保持pH值恒定，加入碱性蛋白酶Alcalase2.4L，加酶量为1000U/g～9000U/g，酶解0.5～5h后，溶液在90℃下灭酶10～20min；最后冷却至40℃～60℃，用1.0mol/LNaOH调节调节溶液pH至6.5～7.5；保持pH值恒定，加入中性蛋白酶Neutrase0.8L，加酶量为1000U/g～11000U/g，酶解0.5～5h后，90℃灭酶10～20min；5000～8000rpm离心10～20min，上清液冷冻干燥后得到核桃活性肽粗粉；加入中性蛋白酶和加入碱性...

【专利技术属性】
技术研发人员：闵伟红，赵凡睿，杨行，刘春雷，方丽，王辑，
申请(专利权)人：吉林农业大学，
类型：发明
国别省市：吉林,22