一种利用茶多酚氧化酶同工酶PPO1酶促合成茶黄素TF的方法技术

一种利用茶多酚氧化酶同工酶PPO1酶促合成茶黄素TF的方法，该方法是以茶多酚氧化酶同工酶PPO1为酶源，以茶多酚中的儿茶素EC和EGC组分为主要反应底物，以一定pH值的缓冲液作为反应体系，经摇床振荡酶促反应以及后续的萃取、离心、浓缩、冷冻干燥等步骤，定向酶促合成单一茶黄素组分TF(theaflavin)的技术及工艺优化。该方法克服了传统以茶叶多酚氧化酶粗酶液酶促合成茶黄素中同时产生多种茶黄素组分、分离纯化茶黄素组分工艺技术繁琐以及制备高纯茶黄素组分难度大等缺陷，实现了酶促合成产物单一、反应终端无副产物的技术创新，避免了茶黄素组分后续分离纯化的技术瓶颈，为茶黄素组分绿色、安全、高效大规模工业化生产与利用奠定了理论和实践依据。

【技术实现步骤摘要】
一种利用茶多酚氧化酶同工酶PPO1酶促合成茶黄素TF的方法
本专利技术属于生物工程制备领域，涉及一种茶黄素TF的制备方法，具体涉及一种茶叶多酚氧化酶同工酶PPO1酶液在茶多酚溶液反应体系中定向酶促合成茶黄素TF的方法。
技术介绍
茶黄素类(theaflavins,TFs)是从红茶中发现具有多羟基的苯骈卓酚酮结构混合物，占红茶干重的0.3％-1.5％，对红茶的色香味和品质起关键作用。现研究表明，茶黄素类具有多种与人体健康有关的药理功效，在预防心脑血管系统疾病、延缓衰老、增强免疫机能、防龋齿、抗肿瘤、抗菌杀病毒等均起作用，素有“脑黄金”之称，是发酵茶类三大色素(茶黄素、茶红素、茶褐素)中功效最明显、科学理论最完善、现阶段最具开发前景的天然产物之一，广泛应用在医药、保健品、日化用品和食品添加剂等领域。现已发现并鉴定的茶黄素组分有二十余种，其中主要以茶黄素(Theaflavin，TF)、茶黄素-3-单没食子酸酯(Theaflavin-3-gallate，TF-3-G)、茶黄素-3'-单没食子酸酯(Theaflavin-3'-gallate，TF-3'-G)和茶黄素-3-3'-双没食子酸酯(Theaflavin-3-3'-gallate，TFDG)四种组分为主。就不同的茶黄素组分而言，生物活性有较大差异。LuJiebo在比较4种主要茶黄素对正常细胞和癌细胞的生长、凋亡、基因表达的作用时发现，10-50μmol的TF能抑制突变体细胞WI38VA和Caco-2结肠癌细胞的生长，且对于相应的正常细胞没有影响，而TFDG没有表现出显著的抑制效果。其机理是一定浓度的TF能在mRNA和蛋白质水平上抑制血清诱导的Cox-2基因的表达，从而诱导细胞凋亡。随着茶黄素的研究深入和生理活性明晰，对其组成、含量和纯度提出更高要求。现有的制备方法主要集中于茶叶直接提取法、酶促合成法、化学氧化合成法，但上述所得到的茶黄素均为多组分的茶黄素类混合物。同时，从茶叶直接提取产能低、成本高、资源浪费明显。化学氧化合成法存在操作复杂、茶黄素得率低、环境污染、试剂残留和安全毒害等系列问题。酶促合成法则因多酚氧化酶组成复杂性及其同工酶的多样性，合成的产物为含有多种茶黄素组分的混合物，并导致分离纯化茶黄素组分工艺技术繁琐以及制备高纯茶黄素组分难度大等问题。王坤波等分别采用梨、茶叶、微生物、苹果、漆酶、蘑菇中的多酚氧化酶粗酶液为酶源，氧化茶多酚溶液形成茶黄素类混合物，且四种主要茶黄素组分生成量差异显著，总茶黄素(TFs)得率为20-52.5％；同时，将上述酶源通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳发现，多酚氧化酶在梨、茶叶、蘑菇、苹果、漆酶中分别有11、5、5、4、1种同工酶，说明多酚氧化酶催化氧化茶多酚合成茶黄素的能力不仅与其酶活有关，还与同工酶本身有关。对于茶黄素类多组分的分离纯化主要包括聚酰胺吸附树脂层析、纤维素柱层析、葡聚糖凝胶层析、硅胶层析和高速逆流色谱等。Berkowltz等人采用纤维素柱层析分离纯化发现，步骤繁琐、制备量小，且仅能得到茶黄素TFDG。丁晓芳等人采用葡聚糖凝胶层析法分离茶黄素组分，仅得到了较理想的两个茶黄素组分，而茶黄素TF-3-G和TF-3'-G难以分开。综合认为，仅用一种分离纯化技术难以获得茶黄素组分的高纯品。此外，上述技术普遍存在成本高、制备量小、工业化程度尚低、分离周期长等突出问题，严重制约了茶黄素组分的开发与利用。中国专利技术专利CN102286565A公开了一种茶黄素单体的制备方法，该方法是将灵芝真菌通过液体发酵培养得到的含有漆酶的酶液以1:20-30的体积比加入到质量浓度1％-3％茶多酚溶液中，经酶促反应以及进一步分离纯化，获得纯度为95％的茶黄素TF-3-G。该专利技术工艺方法简单、节能环保，但也因该酶液的酶活不高，酶促合成茶黄素组分TF-3-G的效率不高，需要使用较大量的酶液，并由此导致的外源酶安全问题引人关注。另外，江和源等人(专利公开号CN1011909099A)专利技术了一种制备四种茶黄素单体的方法，具体方案是将从茶叶中提取的茶黄素类混合物缓慢通过聚酰胺层析柱进行分离纯化获得，但采用的洗脱剂为酯、酮、醇和有机酸等混合物，限制了产品应用范围，同时存在操作繁杂、溶剂残留、工业废弃污染以及得率低、制备量小等问题。由此，结合现有的酶蛋白提取分离、同工酶制备、生物发酵等技术，探索茶叶多酚氧化酶同工酶定向酶促合成单一的茶黄素组分，从源头上改变从茶叶提取茶黄素类再经分离制备茶黄素单体以及利用外源漆酶酶促合成茶黄素TF-3-G的技术现状，有助于推动和扩大茶黄素组分的开发与利用。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是：针对上述现有技术直接从茶叶中提取制备茶黄素和化学氧化制备形成茶黄素类混合物、多酚氧化酶同工酶组成复杂及其酶促合成产物多样、茶黄素组分生物活性差异较大、纯化制备茶黄素组分成本高、工业化程度尚低、操作繁琐等的不足，提供一种利用茶多酚氧化酶同工酶PPO1酶促合成单一茶黄素组分TF的方法，利用特定的茶叶多酚氧化酶同工酶PPO1，通过催化氧化茶多酚溶液转化形成茶黄素组分TF。为了解决上述技术问题，本专利技术所采用的技术方案是：一种利用茶多酚氧化酶同工酶PPO1酶促合成茶黄素TF的方法，该方法步骤如下：1)以茶多酚溶液为底物，以茶多酚氧化酶同工酶PPO1酶液为酶源，按1ml茶多酚氧化酶同工酶PPO1酶液加500-800ml茶多酚溶液的比例，将茶多酚氧化酶同工酶PPO1酶液加入到质量体积浓度为1.2％-3％的茶多酚溶液中；2)以空气作为酶促合成的氧气来源，于20-44℃、60-150r/min摇床振荡下酶促反应30-60min，得酶促反应液；3)于酶促反应液中加入等体积的乙酸乙酯，静置萃取5-30min后以500-3000r/min离心1-5min，取乙酸乙酯层溶液，无机相溶液重复萃取及离心一次，合并乙酸乙酯层溶液，于真空度为-0.05～-0.09Mpa、温度为50～60℃条件下真空浓缩回收乙酸乙酯后，于真空度为-0.05～-0.09MPa、温度为-38～-42℃条件下冷冻干燥，即可。上述1.2％-3％质量体积浓度的茶多酚溶液是将茶多酚溶解于pH值为4.5-6.5的Tris-HCl缓冲液、醋酸钠-醋酸缓冲液或柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中配制而成。其中，茶多酚为市购产品。上述茶多酚氧化酶同工酶PPO1已记载于申请号为201410849876.3、专利技术名称为茶叶多酚氧化酶同工酶单体PPO1和PPO2及其制备方法的申请中，其中对该茶多酚氧化酶同工酶PPO1的分子量、结构、性质和制备过程等已有详细记载。其中，该制备方法于凝胶介质层析二次纯化后所得的二酶液中的一酶液即为茶多酚氧化酶同工酶PPO1，经检测，其酶活力为4340U/ml。与现有技术相比，本专利技术的优点是：1、制备特定的茶叶多酚氧化酶同工酶PPO1定向酶促催化合成单一茶黄素组分TF，改变了以往采用茶叶多酚氧化酶粗酶液酶促合成茶黄素中同时产生多种茶黄素组分的技术现状，实现了利用茶叶多酚氧化酶同工酶定向酶促合成茶黄素组分TF的理论与实践创新。2、在茶叶多酚氧化酶同工酶PPO1定向酶促合成单一茶黄素组分TF过程中，主要是利用底物茶多酚中的EC和EGC组分，底物利用率显著提高，并且产物单一、无副产物，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用茶多酚氧化酶同工酶PPO1酶促合成茶黄素TF的方法，其特征在于：该方法步骤如下：1)以茶多酚溶液为底物，以茶多酚氧化酶同工酶PPO1酶液为酶源，按1:500‑800的体积比将茶多酚氧化酶同工酶PPO1酶液加入到质量体积浓度为1.2％‑3％的茶多酚溶液中；2)以空气作为酶促合成的氧气来源，于20‑44℃、60‑150r/min摇床振荡下酶促反应30‑60min，得酶促反应液；3)于上述酶促反应液中，加入等体积的分析纯乙酸乙酯，静置萃取5‑30min，离心取乙酸乙酯层溶液，对无机相溶液重复萃取及离心一次，合并乙酸乙酯层溶液，真空浓缩回收乙酸乙酯，冷冻干燥，即可。

【技术特征摘要】
1.一种利用茶多酚氧化酶同工酶PPO1酶促合成茶黄素TF的方法，其特征在于：该方法步骤如下：1)以茶多酚溶液为底物，以茶多酚氧化酶同工酶PPO1酶液为酶源，按1:500-800的体积比将茶多酚氧化酶同工酶PPO1酶液加入到质量体积浓度为1.2％-3％的茶多酚溶液中；2)以空气作为酶促合成的氧气来源，于20-44℃、60-150r/min摇床振荡下酶促反应30-60min，得酶促反应液；3)于上述酶促反应液中，加入等体积的分析纯乙酸乙酯，静置萃取5-30min，离心取乙酸乙酯层溶液，对无机相溶液重复萃取及离心一次，合并乙酸乙酯层溶液，真空浓缩回收乙酸乙酯，冷冻干燥，即可。2.如权利要求1所述的一种利用茶多酚氧化酶同工酶PPO1酶促合成茶黄素TF的方法，其特征在于：所述步骤1)中的1.2％-3％质量体积比浓度的茶多酚溶液是将茶多酚溶解...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴浪，
申请(专利权)人：吴浪，
类型：发明
国别省市：陕西,61