抗Her2/PD-1双特异性抗体及其制备方法技术

本发明专利技术公开了抗Her2/PD‑1双特异性抗体及其制备方法，属于生物技术领域。本发明专利技术提供的抗Her2/PD‑1双特异性抗体既能与Her2结合，还能与PD‑1相结合，其通过阻断Her2和/或PD‑1信号传导途径，有效地增强免疫反应，从而可能具有良好的增强抗肿瘤免疫反应的效果。

【技术实现步骤摘要】
抗Her2/PD-1双特异性抗体及其制备方法
本专利技术涉及抗Her2/PD-1双特异性抗体及其制备方法，属于生物

技术介绍
双特异性抗体(bispecificantibody，BiAb)是含有两种特异性抗原结合位点的人工抗体，能在靶细胞和功能分子(细胞)之间架起桥梁，产生导向性的效应功能。BiAb在生物医学中，特别是在肿瘤的免疫治疗中具有广阔的应用前景。通过BiAb介导细胞毒作用杀死肿瘤细胞是当前免疫治疗应用研究的热点，其主要特点是BiAb能同时结合肿瘤相关抗原和免疫效应细胞上的靶分子，直接触发免疫效应细胞对肿瘤细胞的特异性杀伤。大量研究表明，肿瘤在形成过程中，可通过多重机制，逃避免疫系统的监视，我们将这一过程称之为肿瘤组织的免疫逃逸或免疫编辑。PD-1是T细胞表面的蛋白质，亦为被称作「免疫检查点」抑制剂的蛋白质之一。PD-1的正常功能是关闭作为阻止健康免疫系统攻击体内其他细胞的部分过程的T细胞介导免疫应答。PD-1附着到正常细胞或癌细胞表面上的某些蛋白质(被称为PD-1配体1(PD-L1)或PD-1配体2(PD-L2))时，T细胞会关闭其杀死细胞的能力。若干癌细胞产生大量的PD-L1和PD-L2以帮助该等癌细胞逃避T细胞攻击。抗PD-1抗体与PD-1结合并阻断其与PD-L1和PD-L2结合，从而令T细胞杀死癌细胞。T细胞在肿瘤免疫的过程中处于核心地位，如果能调动体内的杀伤武器，将是非常有效且安全的治疗策略。总而言之，既要在体内激活原有自身的免疫系统反应，还要让已经调动的反应持续增强才是免疫治疗肿瘤的最好策略。HER2是一种185kDa的细胞表面受体酪氨酸激酶(cellsurfacereceptortyrosinekinase)和表皮生长因子受体(epidermalgrowthfactorreceptor,EGFR)家族的成员，所述家族包括四种不同的受体：EGFR/ErbB-l、HER2/ErbB-2、HER3/ErbB-3、和HER4/ErbB-4。所述EGFR家族的四种成员形成同二聚体和异二聚体，其中HER2是优选的且是其它ErbB受体的最强的二聚配偶体(Graus-Porta等人，EmboJ1997；16:1647-1655；Tao等人，JCellSci2008；121:3207-3217)。HER2可以通过过表达或通过与其它可以由配体结合而激活的ErbB的异二聚化而激活(Riese和Stern,Bioessaysl998；20:41-48)。对于HER2，还没有鉴定出配体。HER2活化导致受体磷酸化，其通过多种信号途径，如MAPK、磷酸肌醇3-激酶/AKT、JAK/STAT、和PKC，而触发下游的信号级联放大，其最终导致多种细胞功能的调节，如生长、存活、和分化(Huang等人，ExpertOpinBiolTher2009；9:97-110)。对HER2在肿瘤方面的关注很多集中在其在乳腺癌(breastcancer)中的作用，其中HER过表达在大约20％的病例中报道，且其与不良的预后有关联(Reese等人，StemCellsl997；15:1-8；Andrechek等人，ProcNatlAcadSciUSA2000；97:3444-3449；和Slamon等人，Sciencel987；235:177-182)。除了乳腺癌以外，HER2表达还与其它人癌瘤种类关联，包括前列腺癌、非小细胞肺癌、膀胱癌、卵巢癌、胃癌、结肠癌、食管癌、和头和颈的鱗状细胞癌(GarciadePalazzo等人，IntJBiolMarkersl993；8:233-239；Ross等人,Oncologist2003；8:307-325；Osman等人，JUrol2005；174:2174-2177；Kapitanovic等人，Gastroenterology1997；112:1103-1113；Turken等人，Neoplasma2003；50:257-261；和Oshima等人，IntJBiolMarkers2001；16:250-254)。通过联合使用抗PD-1单克隆抗体和抗Her2单克隆抗体，对于治疗癌症，增强自身免疫力有着十分广阔的前景。现有制备双特异性个抗体的方法仍存在大量同源二聚体(＞20％)。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种在中华仓鼠卵巢细胞(CHO)中表达生产双特异性抗体的方法。本专利技术提供的一种表达生产Her2/PD-1双特异性抗体的方法，方法包括以下步骤：(1)以pCHO1.0为表达载体，构建分别表达抗Her2单克隆抗体、抗PD-1单克隆抗体的中华仓鼠卵巢细胞工程菌细胞株；(2)培养所述工程菌细胞株，分别产抗Her2单克隆抗体、抗PD-1单克隆抗体；(3)将抗Her2单克隆抗体、抗PD-1单克隆抗体组装，形成Her2/PD-1双特异性抗体。在本专利技术的一种实施方式中，所述抗Her2单克隆抗体的重链、轻链的氨基酸序列如SEQIDNO.5、SEQIDNO.2所示。在本专利技术的一种实施方式中，所述抗PD-1单克隆抗体的重链、轻链的氨基酸序列如SEQIDNO.6、SEQIDNO.4所示。在本专利技术的一种实施方式中，步骤(2)培养工程菌细胞株的方法，是将二级种子细胞按(1.0±0.3)×106个/ml的接种密度用基础培养基稀释至3L细胞培养反应器中，初始培养体积为1L，设置搅拌转速为250～280r/min，pH设置为6.95±0.15，通过碳酸氢钠溶液和CO2调节pH；溶解氧设置为40±20％；1～4天培养温度设置为36.5±0.5℃；培养第5天降温至33.5±0.5℃；培养第14天收获；第3、5、7、9、11天用补料培养基进行补料，加补料培养基A和补料培养基B，补料培养基A的补料体积为初始培养体积的4％，补料培养基B的补料体积为初始培养体积的0.4％，当葡萄糖浓度低于2.0～3.0g/L时，添加葡萄糖浓缩液提高细胞培养液的葡萄糖浓度至4.0～5.0g/L。在本专利技术的一种实施方式中，步骤(2)还包括对抗Her2单克隆抗体、抗PD-1单克隆抗体进行纯化的过程，具体地，对工程菌的培养上清进行深层过滤去除细胞，收获澄清液，采用GEMabselectedSure填料，亲和纯化抗Her2抗体和抗PD-1抗体。在本专利技术的一种实施方式中，步骤(3)将纯化后的抗Her2抗体和抗PD-1抗体按照1：1比例混合，添加精氨酸和还原性谷胱甘肽至终浓度分别为10～200mM和60～140mM，用Tris调节pH至7.5～8.5，37℃孵育3～5小时。所述种子培养基是CHO无血清培养基：CDCHOAGT24.6g/L；所述基础培养基是DynamisAGT24.8g/L；所述葡萄糖浓缩液是葡萄糖200g/L；所述碳酸氢钠溶液是NaHCO390.7g/L。所述补料培养基A是CHOCDEfficientFeedA；所述补料培养基B是CHOCDEfficientFeedB。本专利技术的有益效果：本专利技术提供的一种双特异性抗体的制备方法，与传统的双特异性抗体制备相比，该方法能够大幅降低同源二聚体的形成，所得双抗纯度可以达到96.3％，同源二聚体的比例只有不到3％。附图说明图1双特异性抗体表达示意图图2抗Her2和抗PD-1单克隆抗本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种在中华仓鼠卵巢细胞(CHO)中表达生产双特异性抗体的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)以pCHO1.0为表达载体，构建分别表达抗Her2单克隆抗体、表达抗PD‑1单克隆抗体的中华仓鼠卵巢细胞工程菌细胞株；(2)培养所述工程菌细胞株，分别产抗Her2单克隆抗体、抗PD‑1单克隆抗体；(3)将抗Her2单克隆抗体、抗PD‑1单克隆抗体组装，形成Her2/PD‑1双特异性抗体。

【技术特征摘要】
1.一种在中华仓鼠卵巢细胞(CHO)中表达生产双特异性抗体的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)以pCHO1.0为表达载体，构建分别表达抗Her2单克隆抗体、表达抗PD-1单克隆抗体的中华仓鼠卵巢细胞工程菌细胞株；(2)培养所述工程菌细胞株，分别产抗Her2单克隆抗体、抗PD-1单克隆抗体；(3)将抗Her2单克隆抗体、抗PD-1单克隆抗体组装，形成Her2/PD-1双特异性抗体。2.根据权利要求1所述的一种在中华仓鼠卵巢细胞(CHO)中表达生产双特异性抗体的方法，其特征在于，所述抗Her2单克隆抗体的重链、轻链的氨基酸序列如SEQIDNO.5、SEQIDNO.2所示。3.根据权利要求2所述的一种在中华仓鼠卵巢细胞(CHO)中表达生产双特异性抗体的方法，其特征在于，所述抗PD-1单克隆抗体的重链、轻链的氨基酸序列如SEQIDNO.6、SEQIDNO.4所示。4.根据权利要求1所述的一种在中华仓鼠卵巢细胞(CHO)中表达生产双特异性抗体的方法，其特征在于，步骤(2)培养工程菌细胞株的方法，是将二级种子细胞按(1.0±0.3)×106个/ml的接种密度稀释至3L细胞培养反应器中，3L细胞培养反应器中装有1L的基础培养基，设置搅拌转速为250～280r/min，pH设置为6.95±0.15，通过碳酸氢钠溶液和CO2调节pH；溶解氧设置为40±20％；1～4天培养温度设置为36.5±0.5℃；培养第5天降温至33.5±0.5℃；培养第14天收获；第3、5、7、9、11天用补料培养基进行补料，补加补料培...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘金涛，宋莉，
申请(专利权)人：苏州塞恩塔生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32