利用单亚基RNA聚合酶进行体外转录合成sgRNA的方法技术

本发明专利技术公开一种利用单亚基RNA聚合酶进行体外转录合成sgRNA的方法，所述的单亚基RNA聚合酶，为来自

【技术实现步骤摘要】
利用单亚基RNA聚合酶进行体外转录合成sgRNA的方法
本专利技术属于微生物核酸代谢酶研究领域，具体涉及利用单亚基RNA聚合酶进行体外转录合成sgRNA的方法。
技术介绍
SgRNA(single-guideRNA)是CRISPR基因编辑系统中重要的组成部分，早先发现的guideRNA由两部分组成—crRNA和tracRNA,两者“双剑合璧”后，即sgRNA能更方便也更稳定的行使定点导向的功能，与Cas9蛋白结合，引导Cas9蛋白靶向剪切目的基因。CRISPR是大多数细菌及古细菌中的一种获得性免疫方式，是一套很巧妙的系统。它先把外来的DNA片段整合进细菌自己的基因组，然后转录出RNA，经过一些剪切后，并利用这些guideRNA把带有核酸内切酶活性的Cas蛋白直接引导到外源序列的位置，将外源DNA切断。对细菌或古细菌而言，就完成了对外来病原体的快速精准的打击。至于最近很火的CRISPR技术其实是利用CRISPR系统中的RNA引导Cas蛋白去切断目标DNA的这一个步骤。当然CRISPR的爆火主要还是由于这套技术好用，是因为要达成基因敲除的目的，只需把两个质粒导入细胞即可大功告成。一个是含有Cas9蛋白的表达基因，它可以切断双链DNA。另一个是用来表达sgRNA,前一部分与目标基因配对，后一部分可形成发夹结构与Cas9蛋白结合，切断目标基因。这是传统构建CRISPR系统的方法。随着RNA研究的发展及RNA导入细胞方法的完善，目前也可以通过将Cas9mRNA和sgRNA导入细胞而发挥基因编辑功能。RNA转运至细胞内就可以翻译成蛋白质或直接发挥作用后被迅速降解，与导入质粒法不同(DNA会一直存在细胞中)，这种方法不会造成基因突变的危险。SgRNA的体外制备方法有化学合成和酶法合成这两种。由于RNA本身不稳定的性质，RNA的化学合成远不如DNA合成高效，目前化学合成RNA多限于短RNA(几个到几十个核苷酸长度)，且合成费用高。酶法合成RNA是在RNA聚合酶体外转录基础上建立的生物制备方法。相对于化学合成，酶法合成具有效率高、条件温和的特性，能够合成长序列RNA，更易于实现较大规模生产,是一种发展前景良好的RNA合成方法。目前体外酶法合成RNA主要是利用T7RNA聚合酶，在体外从带有T7启动子序列的DNA模版上反复转录产生大量所需的RNA。虽然大部分生物自身拥有RNA聚合酶，但是大多都具有复杂的亚基组成和调控机制，不适合用作体外合成RNA的酶工具，这使得T7RNA聚合酶几乎成为了RNA酶法合成中唯一的工具酶。T7RNA聚合酶于四十年前被鉴定，其选择受限于当时已发现的有限噬菌体种类，无法保证它是一个最理想的RNA合成工具酶。它的最主要缺点包括：提前终止、延伸性能弱、产物末端不均一、必须以鸟苷酸起始、对修饰核苷酸掺入效率低、对富含高级结构的RNA转录效率低等等，以致很多情况下所需的RNA无法有效合成。因而选择T7作为体外合成RNA的标准酶具有很大的随机性。在随后的数十年中，人们对T7RNA聚合酶进行了大量的优化和改造，相关论文和专利不计其数，然而这个酶并不是天然为RNA体外合成而设，其主要缺点越来越成为RNA这一热门研究和应用领域的限制因素。KP34RNA聚合酶是我们最新发现的一类单亚基RNA聚合酶，它来自类噬菌体。类噬菌体与T7类、SP6类和P60类(含Syn5)亲缘关系较远，且其成员间异质性最大。并且KP34RNA聚合酶与已知的T7类和Syn5类单亚基RNA聚合酶在氨基酸序列、蛋白质大小、进化地位以及功能特征等方面存在显著差异。这也暗示着KP34RNA聚合酶的转录体系与T7和Syn5RNA聚合酶的转录体系差异很大。通过研究发现KP34RNA聚合酶在T7和Syn5转录系统的几个薄弱环节中显示出明显的优势，尤其是能产生精确均一的产物末端及对富含二级结构的RNA(如sgRNA)转录效果非常好。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是克服现有技术中化学合成和T7RNA聚合酶体外转录合成sgRNA方法的缺陷，提供一种利用单亚基RNA聚合酶进行体外转录合成sgRNA的方法，从而制得具有产物末端均一性、稳定性、输送性优良的sgRNA，所述sgRNA为103ntsgRNA，该sgRNA可用于CRISPR基因编辑等。本专利技术的另一目的是提供所述KP34RNA聚合酶在体外转录合成RNA中的应用，为相关研究领域合作者解决难于合成的RNA原料问题。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案是：利用单亚基RNA聚合酶进行体外转录合成sgRNA的方法，包括以下步骤：S1、获得所需sgRNA的DNA转录模板；S2、加入所述单亚基RNA聚合酶，转录模板，pH8.0Tris-HCl，DTT，氯化镁，亚精胺，四种核糖核苷三磷酸ATP、GTP、CTP、UTP，RNA酶抑制剂，无机焦磷酸酶，DEPC水混合后进行体外转录反应；S3、加入DNaseI去除DNA模板；S4.纯化回收转录产物。进一步的，所述单亚基RNA聚合酶为类噬菌体KP34的RNA聚合酶，所述sgRNA如序列表SEQIDNO.1所示。优选的，步骤S1所述sgRNA转录模板包含一个RNA聚合酶启动子、一个20nt靶标特异性区域和一个83bp的恒定区域。优选的，步骤S2所述转录反应的温度为37℃，反应的时间为1～2h。当转录时间达到1h以上可以得到大量的转录产物，转录效果较好，综合考虑转录反应时间为1～2h较佳。进一步的，所述DNA转录模板为线性化的质粒DNA模板、PCR产物模板或合成的DNA寡核苷酸模板。进一步的，所述线性化质粒DNA模板的构建具体步骤如下：(1)通过无缝连接的方法把sgRNA和KP34RNA聚合酶启动子克隆到pUC19质粒载体上，同时在sgRNA后面添加一个BspQI酶切位点，提取pUC19质粒；(2)采用BspQI限制性内切酶线性化pUC19质粒，电泳检测，纯化回收。进一步的，所述PCR产物模板的获取步骤为：通过PCR体系扩增pUC19载体序列，使正向引物上带有KP34RNA聚合酶的启动子序列，电泳检测，纯化回收PCR产物。进一步的，所述PCR体系：2XPrimeSTARMax10μl，pUC19质粒1ng，正向引物0.5μM，反向引物0.5μlM，ddH2O补至25μl；PCR程序:98℃预变性5min；98℃变性10s、55℃退火10s、72℃延伸5s、30个循环；72℃终延伸10min。进一步的，所述DNA寡核苷酸模板的合成步骤为：合成两条互补的DNA单链，DEPC水溶解稀释至50μΜ，分别吸取20μl50μM完全互补的两条单链DNA，再加入5μl10X引物退火缓冲液混合均匀后于金属浴95℃5min，自然降温退火成双链。进一步的，所述两条互补的DNA单链包括正向单链和互补链，所述正向单链的碱基序列如序列表SEQIDNO.2所示，所述互补链的碱基序列如序列表SEQIDNO.3所示。以线性化质粒作模板能保证DNA模板末端的均一性，极大地降低了转录产物末端出现不均一的概率；进一步的，步骤S4所述纯化转录产物的方法有试剂盒纯化法、乙醇沉淀法、RNA氯化锂沉淀法。试剂盒纯化法适用于小量检测型，乙醇沉淀法，可以沉淀小片段和大片段RNA，但也会沉淀出蛋白质，所以必须先用酚/氯仿抽提，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.利用单亚基RNA聚合酶进行体外转录合成sgRNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、获得所需sgRNA的DNA转录模板；S2、加入所述单亚基RNA聚合酶，转录模板，pH8.0Tris‑HCl，DTT，氯化镁，亚精胺，四种核糖核苷三磷酸ATP、GTP、CTP、UTP，RNA酶抑制剂，无机焦磷酸酶，DEPC水混合后进行体外转录反应；S3、加入DNase I去除DNA模板；S4.纯化回收转录产物；所述单亚基RNA聚合酶为

【技术特征摘要】
1.利用单亚基RNA聚合酶进行体外转录合成sgRNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、获得所需sgRNA的DNA转录模板；S2、加入所述单亚基RNA聚合酶，转录模板，pH8.0Tris-HCl，DTT，氯化镁，亚精胺，四种核糖核苷三磷酸ATP、GTP、CTP、UTP，RNA酶抑制剂，无机焦磷酸酶，DEPC水混合后进行体外转录反应；S3、加入DNaseI去除DNA模板；S4.纯化回收转录产物；所述单亚基RNA聚合酶为类噬菌体KP34的RNA聚合酶,所述sgRNA如序列表SEQIDNO.1所示。2.如权利要求1所述的利用单亚基RNA聚合酶进行体外转录合成sgRNA的方法，其特征在于，步骤S1中所述的转录模板包含一个RNA聚合酶启动子、一个20nt靶标特异性区域以及一个83bp恒定区域。3.如权利要求1所述的利用单亚基RNA聚合酶进行体外转录合成sgRNA的方法，其特征在于，步骤S2所述转录反应的温度为37℃，反应时间为1-2h。4.如权利要求1所述的利用单亚基RNA聚合酶进行体外转录合成sgRNA的方法，其特征在于，所述DNA转录模板为线性化的质粒DNA模板、PCR产物模板或合成的DNA寡核苷酸模板。5.如权利要求4所述的利用单亚基RNA聚合酶进行体外转录合成sgRNA的方法，其特征在于，所述线性化质粒DNA模板的构建具体步骤如下：(1)通过无缝连接的方法把sgRNA和KP34RNA聚合酶启动子克隆到pUC19质粒载体上，同时在sgRNA后面添加一个BspQI酶切位点，提取pUC19质粒；(2)采用BspQI限制性内切酶线性化pU...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱斌，陆雪玲，夏恒，黄锋涛，吴慧，余兵兵，闫艳，
申请(专利权)人：武汉核圣生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北,42