本发明专利技术提供了一种人源分子改造杀虫蛋白及其制备方法与应用，属于基因工程和生物防治领域。本发明专利技术提供了一种人源分子改造杀虫蛋白，所述杀虫蛋白CCL‑CCL_scFv的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。所述杀虫蛋白CCL‑CCl_scFv与小菜蛾(Plutella xylostella)中肠BBMV的亲和力显著高于Cry1Ab毒素，且与Cry1Ab和Cry1Ac毒素竞争结合小菜蛾中肠BBMV，为Cry1Ab和Cry1Ac毒素的模拟物；经小菜蛾室内杀虫生物活性测定，3d致死率可达55.35％，可有效的替代Cry1Ac毒素用于生物防治虫害。
【技术实现步骤摘要】
一种人源分子改造杀虫蛋白、编码基因及其设计方法与应用
本专利技术涉及基因工程和生物防治领域，具体涉及一种人源分子改造杀虫蛋白、编码基因及其设计方法与应用。
技术介绍
苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis，Bt)是一种昆虫病原菌，其主要杀虫活性物质为细胞内毒素伴胞晶体蛋白，对多种农业害虫具有特异性毒杀作用(BravoandSoberon，2008)；Cry1Ac是Bt毒素的一种，其对鳞翅目昆虫的靶标受体主要包括中肠刷状缘膜囊泡(brushbordermembranevesicles，BBMV)上的碱性磷酸酶(alkalinephosphatase，ALP)、氨肽酶(aminopeptidaseN，APN)和钙粘蛋白(cadherin)。ALP作为Cry1A毒素的受体，可促进毒素对膜的插入和孔道形成。诸多从双翅目和鳞翅目昆虫物种中分离出的ALP已被鉴定为Cry1Ac毒素的受体。抗Cry1Ac毒素独特型单链抗体(Anti-idiotypeantibodyscFvs，Anti-IdscFvs)，可以模拟Cry1Ac毒素的结构与功能。Bt毒素使用量增加使其在害虫抗药性及次生害虫上升等方面存在生态风险(BravoandSoberon，2008；Pigottetal，2008)，这一现状促使高特异活性和新功能类的Bt毒素抗虫资源的积极开发，Cry1Ab毒素抗独特型单链抗体由于可模拟Cry1Ab毒素并与其竞争受体蛋白，已成为目前国内外科研的重点，专利号为ZL201410037000.9的中国专利公开了一种人源抗虫基因及其编码的抗Cry1Ab毒素独特型单链抗体B12(以下简称B12)，其能模拟Bt毒素并用作生物农药防治虫害，取得了积极的效果，但是该抗体的可溶性表达蛋白丧失了与昆虫BBMV结合能力，杀虫效果不甚理想。基因工程(geneticengineering)又称基因拼接技术和DNA重组技术，是以分子遗传学为理论基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段。将不同来源的基因按预先设计的蓝图，通过对DNA分子进行人工“剪切”和“拼接”，对生物的基因进行改造和重新组合，在体外构建重组DNA分子，然后导入活细胞，产生出人类所需要的基因产物。如DeMaagd于2002年针对Cry1Ab毒素在替换上Cry1C毒素的domainIII后，对甜菜夜蛾的毒性较Cry1C提高了近10倍。随着对抗体结构与功能关系的认知不断加深，借助计算机模拟技术进行抗体改造可以在限定范围内有目的地进行设计，根据抗体-抗原结合的氨基酸位点分析进行设计与定向改造，Wong等(1995)在已知抗原-抗体复合物三维结构的基础上，对抗苯偶氮基胂酸酯(anti-p-azophenylarsonate)Fab重链108位上的Phe定点突变为Trp之后，相对野生抗体而言，突变体亲和力就提高了10倍；为进一步对抗体分子结合区域改造指明了方向，但目前结合链替换分子改造方法来提高抗Bt毒素抗独特型单链抗体亲和力的方法并通过Octet技术平台筛选的方法尚未见报道。
技术实现思路
针对上述问题，本专利技术提供了一种人源分子改造杀虫蛋白、编码基因及其设计方法与应用，所述人源分子改造杀虫蛋白与小菜蛾(Plutellaxylostella)中肠BBMV的亲和力比Cry1Ab毒素高，且与Cry1Ab和Cry1Ac毒素竞争结合小菜蛾中肠BBMV，为Cry1Ab和Cry1Ac毒素的模拟物。可有效的替代Cry1Ac毒素用于生物防治虫害，且具有杀虫效果。本专利技术提供了一种人源分子改造杀虫蛋白CCL-CCL_scFv，所述杀虫蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo.1所示。本专利技术提供了上述人源分子改造杀虫蛋白CCL-CCL_scFv的设计方法，包括如下步骤：1)对抗Cry1Ab毒素独特型单链抗体B12_scFv和Cry1A类毒素的氨基酸序列进行BLAST比对分析，得到B12_scFv与Cry1A类毒素的相似序列，分别为H-CDR1，L-CDR1，L-CDR2和GS-linker；2)用所述GS-linker将两个包含L-CDR1和L-CDR2序列的轻链区(VL)首尾连接，得到人源分子改造杀虫蛋白CCL-CCL_scFv。本专利技术提供了一种杀虫剂，包括上述人源分子改造杀虫蛋白或上述方法设计得到的人源分子改造杀虫蛋白。本专利技术提供了一种编码人源分子改造杀虫蛋白的基因，所述基因包括(a)和(b)所示的基因：(a)由SEQIDNo.2所示的核苷酸序列组成的的基因；(b)在(a)限定的核苷酸序列基础上经密码子优化得到的基因。优选的，所述(b)基因由SEQIDNo.3所示的核苷酸序列组成。本专利技术还提供了一种含有上述基因的重组载体。本专利技术还提供了上述人源分子改造杀虫蛋白、上述设计方法得到的人源分子改造杀虫蛋白、上述杀虫剂、基因或重组载体在农作物害虫防治方面的应用。优选的，所述害虫包括小菜蛾。优选的，所述农作物包括十字花科农作物。有益效果：(1)本专利技术提供了一种人源分子改造杀虫蛋白CCL-CCL_scFv，所述人源分子改造杀虫蛋白CCL-CCL_scFv的氨基酸序列如SEQIDNo.1所示。本专利技术提供的人源分子改造杀虫蛋白与小菜蛾BBMV的亲和力显著高于B12_scFv和Cry1Ab毒素；其可与Cry1Ab和Cry1Ac毒素竞争结合小菜蛾的BBMV，且与Cry1Ac的竞争性更强，为Cry1Ab和Cry1Ac毒素的模拟物。经小菜蛾室内杀虫生物活性测定，3d致死率可达55.35％，可有效的替代Cry1Ac毒素用于生物防治虫害。同时本专利技术提供的人源分子改造杀虫蛋白CCL-CCL_scFv由B12_scFv基因分子改造拼接所获得，抗体骨架区未变，与B12_scFv同属于人源抗体，因此CCL-CCL_ScFv应用于农业虫害防治时，对人体危害小。(2)本专利技术提供了上述人源分子改造杀虫蛋白的设计方法，先对抗Cry1Ab毒素独特型单链抗体B12_scFv和Cry1A类毒素的氨基酸序列进行BLAST比对分析，得到B12_scFv与Cry1A类毒素的相似序列H-CDR1，L-CDR1和L-CDR2和GS-linker；再用GS-linker将两个包含L-CDR1和L-CDR2序列的轻链区首尾连接，得到人源分子改造杀虫蛋白CCL-CCL_scFv。本专利技术提供的方法与传统抗体改造方法(易错PCR等)相比，避免了盲目性，成功率高；且以计算机分子模拟为基础，在已知蛋白三维结构及功能等方面信息的基础上，预测分子间结合区域并确定关键氨基酸残基，更加准确的反应了抗体蛋白作用界面的特征，从而使得分子模拟计算更加准确，大大提高了预测准确度。附图说明图1为本专利技术所述人源分子改造杀虫蛋白CCL-CCL_scFv设计图；图2为本专利技术实施例3中B12_scFv、改造后的CCL-CCL_scFv、CCH-CCH_scFv和Bt毒素Cry1Ab的三维结构示意图；其中，图2-A为B12_scFv的三维结构示意图(选取scFvMAB198的1f3r.1.B作为模板)；图2-B为CCL-CCL_scFv的三维结构示意图(选取Anti-IL12Anti-IL18DFab轻链区4hjj.1.c作为模板)；图2-C为CCH-CCH_scFv的三维结构示意图(选本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种人源分子改造杀虫蛋白，其特征在于，所述人源分子改造杀虫蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNo.1所示。
【技术特征摘要】
1.一种人源分子改造杀虫蛋白，其特征在于，所述人源分子改造杀虫蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo.1所示。2.权利要求1所述人源分子改造杀虫蛋白的设计方法，其特征在于，包括如下步骤：1)对抗Cry1Ab毒素独特型单链抗体B12_scFv和Cry1A类毒素的氨基酸序列进行BLAST比对分析，得到B12_scFv与Cry1A类毒素的相似序列，分别为H-CDR1，L-CDR1，L-CDR2和GS-linker；2)用所述GS-linker将两个包含L-CDR1和L-CDR2序列的轻链区首尾连接，得到人源分子改造杀虫蛋白CCL-CCL_scFv。3.一种杀虫剂，其特征在于，包括权利要求1所述的人源分子改造杀虫蛋白或权利要求2所述方法设计得到的人源分子改造杀虫蛋白。4.一种编码人源...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘贤金，谢雅晶，徐重新，张霄，高美静，何鑫，刘媛，张存政，
申请(专利权)人：江苏省农业科学院，
类型：发明
国别省市：江苏,32
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