一种耐热保护剂及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种耐热保护剂及其应用，属于生物制品制备技术领域。本发明专利技术的耐热保护剂含有明胶1%~4%，蔗糖5%~15%或海藻糖1%~5%，山梨醇1%~4%或甘露醇1%~3%，胰蛋白胨1%~4%或脱脂奶2%~6%，L‑谷氨酸钠0.005%~0.1%或精氨酸0.5%~3%，溶剂为PBS溶液。疫苗中添加了本发明专利技术的耐热保护剂，使得活疫苗可在2‑8℃保存24个月，病毒含量和效价不降低，从而降低了保存要求，便于活疫苗的储存和运输，降低了生产成本。

【技术实现步骤摘要】
一种耐热保护剂及其应用
本专利技术涉及生物制品制备
，具体地涉及一种疫苗用的耐热保护剂。
技术介绍
鸭瘟（DuckPlague，DP），是由鸭瘟病毒（DuckPlagueVirus，DPV）引起的鸭、鹅及多种雁目禽类的一种急性败血性传染病。DPV传播迅速，流行广泛，发病率和死亡率非常高，给养鸭业造成巨大的经济损失，是危害养鸭业的最为严重的传染病之一。免疫接种鸭瘟病毒疫苗是防制鸭瘟的有效措施之一，生产鸭瘟病毒疫苗需要培养大量的鸭瘟病毒液。我国目前繁殖鸭瘟病毒所用的细胞为鸡胚成纤维原代细胞（CEF）。虽然国家已规定所使用的鸡胚必须来源于SPF鸡群，但是由于检测的滞后性及饲养环境的复杂性，使得生产鸭瘟用CEF细胞存在外源病毒污染的安全隐患；另外，生产时要用大量鸡胚，劳动强度大，同时也加大了CEF细胞被污染的可能性。目前已有报道表明鸡肝癌细胞系可作为鸭瘟病毒的宿主细胞，但是鸡肝癌细胞极不易培养，增加了鸭瘟病毒培养的生产成本。DF-1细胞是一种可传代的鸡成纤维细胞系，来源于ELL鸡胚胎，该细胞在形态上呈纤维状。DF-1细胞系是一种稳定的、无肿瘤基因、自发无限增殖的细胞系。目前已有研究表明传染性法式囊病毒、鸡马立克氏病毒、新城疫病毒均能在DF-1细胞上生长良好，但是没有DF-1细胞系培养鸭瘟病毒方法的报道。现有技术中鸭瘟活疫苗的保存方法是-15℃以下保存24个月，该疫苗从生产、检验到出厂，再从经销商到用户至少需经2个月的时间，此间一旦储存温度超过-15℃这个“冷链”，就会造成疫苗中活病毒含量下降，影响疫苗的使用效果，甚至造成免疫失败。同时这种保存条件在一定程度上增加了保存成本，不利用运输和储存。若能提供一种保存条件温和的鸭瘟活疫苗，则有利于降低疫苗的保存成本，减少因保存条件改变所带来的疫苗品质的下降。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术的目的是在于提供一种有效降低疫苗保存成本的疫苗用耐热保护剂。本专利技术首先提供一种适用于疫苗的耐热保护剂，包括以下配比的组分，明胶1%~4%，蔗糖5%~15%或海藻糖1%~5%，山梨醇1%~4%或甘露醇1%~3%，胰蛋白胨1%~4%或脱脂奶2%~6%，L-谷氨酸钠0.005%~0.1%或精氨酸0.5%~3%，溶剂为PBS溶液；所述%为各组分质量与耐热保护剂总体积的质量体积比。进一步地，本专利技术的耐热保护剂包括以下配比的组分：明胶1.5%~4%，蔗糖8%~12%或海藻糖2%~5%，山梨醇2%~4%或甘露醇1.5%~3%，胰蛋白胨1.5%~4%或脱脂奶2%~6%，L-谷氨酸钠0.005%~0.05%或精氨酸1%~3%，溶剂为0.01-0.05M的PBS溶液。优选地，本专利技术的耐热保护剂包括以下配比的组分：明胶2%~4%，蔗糖9%~12%或海藻糖2.5%~5%，山梨醇2.5%~4%或甘露醇2%~3%，胰蛋白胨2%~4%或脱脂奶2%~5%，L-谷氨酸钠0.008%~0.03%或精氨酸1.5%~3%，溶剂为0.01-0.02M的PBS溶液。更优选地，本专利技术的耐热保护剂包括以下配比的组分：明胶2%，蔗糖10%，山梨醇4%，胰蛋白胨3%，L-谷氨酸钠0.01%；或，明胶1%，蔗糖15%，山梨醇4%，胰蛋白胨4%，L-谷氨酸钠0.005%；或，明胶4%，蔗糖5%，山梨醇2%，胰蛋白胨1%，L-谷氨酸钠0.1%；或，明胶2%，海藻糖5%，山梨醇3%，脱脂奶5%，精氨酸1.5%；或，明胶2%，蔗糖10%，甘露醇3%，脱脂奶2%，L-谷氨酸钠0.1%；或，明胶4%，海藻糖1%，甘露醇2%，脱脂奶4%，精氨酸3%；以上配比溶剂均为0.01M的PBS溶液。本专利技术提供了上述耐热保护剂的制备方法，包括以下步骤：（1）制备A液按配方称取明胶、蔗糖（或过滤除菌的海藻糖）和胰蛋白胨（或脱脂奶），加入PBS溶液中至完全溶解，灭菌；（2）制备B液按配方称取山梨醇（或甘露醇）和L-谷氨酸钠（精氨酸），加入PBS溶液中至完全溶解，除菌；（3）将A液和B液按体积比1:1混合，制得耐热保护剂。含有本专利技术耐热保护剂的生物制品属于本专利技术的保护范围。进一步地，所述生物制品为疫苗。本专利技术提供了含有上述耐热保护剂的鸭瘟活疫苗、鸡传染性法氏囊病活疫苗、新城疫活疫苗、伪狂犬病活疫苗或和高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗。进一步地，所述鸭瘟活疫苗的鸭瘟病毒为CEF细胞培养的鸭瘟病毒，或DF-1细胞培养的鸭瘟病毒。本专利技术提供了上述耐热保护剂在延长疫苗保存期或提高疫苗耐热性能中的应用。本专利技术实施例所述的鸭瘟活疫苗中的鸭瘟病毒是以鸡胚成纤维细胞系DF-1为宿主培养得到的。所述鸭瘟活疫苗通过以下步骤制备得到：（1）超剂量鸭瘟病毒液接种DF-1细胞；（2）接毒后5-10日收获含病毒的细胞液，反复冻融后按照步骤（1）再次接种DF-1细胞，如此盲传多代，至接种鸭瘟病毒后120小时内CPE达75%以上时收获病毒液；（3）收获的病毒液冻融后按照与DF-1细胞液0.5%-5%的体积比接种于DF-1细胞，培养，收获鸭瘟病毒液，鸭瘟病毒液中病毒含量不低于107.0TCID50/ml；（4）按照与病毒液体积比1:1~1:5加入耐热保护剂。步骤（1）所述超剂量为不低于106.5TCID50/ml的病毒液按照与DF-1细胞液体积比的3%-12%接种量。优选地，步骤（1）所述超剂量为106.5-107.5TCID50/ml的病毒液按照与DF-1细胞液体积比的3%-12%接种量。更优选地，步骤（1）所述超剂量为107.5TCID50/ml的病毒液按照与DF-1细胞液体积比的3%-8%接种量。在本专利技术一个较佳实施例中，采用107.5TCID50/ml的病毒液按照与DF-1细胞液体积比的5%接种量。本领域技术人员应当理解，无论采用上述列举的任一病毒含量或体积比，只要鸭瘟病毒的接种量足够大均适用于本专利技术的技术方案。步骤（1）所述DF-1细胞液中添加9-11日龄的SPF鸡胚尿囊液。步骤（1）所述DF-1细胞液中添加体积比3%-8%的9-11日龄的SPF鸡胚尿囊液。步骤（2）中，优选地，接毒后6-9日收获细胞液。优选地，反复冻融后按照步骤（1）再次接种DF-1细胞，如此盲传多代，至接种后120小时内CPE达75%以上时收获病毒液；更优选地，至接种后72小时内CPE达75%以上时收获病毒液。步骤（3）所述DF-1细胞液中不添加鸡胚尿囊液。本专利技术的鸭瘟活疫苗每羽份疫苗中病毒含量不低于103.5TCID50。本专利技术实施例所用的DF-1细胞培养液含90%～92％体积百分比的DMEM/F12液、抗生素和8%～10％体积百分比的牛血清，细胞培养液的pH值为7.0～7.2。所述的抗生素为100IU/ml青霉素和100IU/ml链霉素的组合。本专利技术实施例所用DF-1细胞维持液含95%～98％体积百分比的DMEM/F12液、抗生素和2%～5％体积百分比的牛血清，细胞维持液的pH值为7.2～7.4。所述的抗生素为100IU/ml青霉素和100IU/ml链霉素的组合。本专利技术不限于上述列举的细胞培养液和细胞维持液的配方，本领域技术人员可以采用本领域公知公用的其他能够培养DF-1的方法来培养DF-1细胞系按照本专利技术的培养方法，均能够实现本专利技术预期的技术效果。细胞传代时经EDTA-胰酶消化传代，用细胞培养液本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种耐热保护剂，其特征在于，包括以下配比的组分：明胶1%~4%，蔗糖5%~15%或海藻糖1%~5%，山梨醇1%~4%或甘露醇1%~3%，胰蛋白胨1%~4%或脱脂奶2%~6%，L‑谷氨酸钠0.005%~0.1%或精氨酸0.5%~3%，溶剂为PBS溶液；所述%为各组分质量与耐热保护剂总体积的质量体积比。

【技术特征摘要】
1.一种耐热保护剂，其特征在于，包括以下配比的组分：明胶1%~4%，蔗糖5%~15%或海藻糖1%~5%，山梨醇1%~4%或甘露醇1%~3%，胰蛋白胨1%~4%或脱脂奶2%~6%，L-谷氨酸钠0.005%~0.1%或精氨酸0.5%~3%，溶剂为PBS溶液；所述%为各组分质量与耐热保护剂总体积的质量体积比。2.根据权利要求1所述的耐热保护剂，其特征在于，包括以下配比的组分：明胶1.5%~4%，蔗糖8%~12%或海藻糖2%~5%，山梨醇2%~4%或甘露醇1.5%~3%，胰蛋白胨1.5%~4%或脱脂奶2%~6%，L-谷氨酸钠0.005%~0.05%或精氨酸1%~3%，溶剂为0.01-0.05M的PBS溶液。3.根据权利要求1所述的耐热保护剂，其特征在于，包括以下配比的组分：明胶2%~4%，蔗糖9%~12%或海藻糖2.5%~5%，山梨醇2.5%~4%或甘露醇2%~3%，胰蛋白胨2%~4%或脱脂奶2%~5%，L-谷氨酸钠0.008%~0.03%或精氨酸1.5%~3%，溶剂为0.01-0.02M的PBS溶液。4.根据权利要求1所述的耐热保护剂，其特征在于，包括以下配比的组分：明胶2%，蔗糖10%，山梨醇4%，胰蛋白胨3%，L-谷氨酸钠0.01%；或，明胶1%，蔗糖15%，山梨醇4%，胰蛋白胨4%，L-谷氨酸钠0.005%；或，明胶4%，蔗糖5%，山梨醇2%，胰蛋白胨1%，L-谷氨酸钠0.1%；或，明胶2%，海藻糖5%，山梨醇3%，脱脂奶5%，精氨酸1.5%；或，明胶2%，蔗糖10%，甘露醇3%，脱...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡美容，林德锐，齐冬梅，郑铁锁，李嘉爱，
申请(专利权)人：广东永顺生物制药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44