本发明专利技术涉及一种山丹脱毒快繁方法，包括如下步骤：蒴果取材、表面灭菌、胚珠培养、组培苗病毒检测、试管苗扩繁、试管鳞茎膨大及生根。本发明专利技术无毒苗获得不经愈伤组织途径，由不含病毒的胚珠直接诱导形成大量初代无毒山丹试管苗，操作简单、培养周期短、脱毒彻底，污染率低，从胚珠接种到萌发只需要40d左右的时间，脱毒率达到100%，基本不会发生污染，并且不会对山丹野生资源造成破坏。同时，由于再生过程不经愈伤组织途径，不容易引起基因变异，本发明专利技术繁殖系数高达7.26，并能在短时间内获得大规格的试管鳞茎，91.3%试管鳞茎重量超过0.5g，并且试管鳞茎膨大和诱导生根同步进行。
【技术实现步骤摘要】
一种山丹脱毒快繁方法
本专利技术涉及一种快繁方法，尤其是一种山丹脱毒快繁方法，属于组织培养领域。
技术介绍
山丹（LiliumpumilumDC.）为百合科百合属多年生草本植物，其株形秀丽、花瓣反卷、花色美丽娇艳，极具观赏价值，适宜成片种植于疏林下、草坪边，也可用于花坛、花境及盆栽观赏。同时，山丹还是重要的中药材，其地下鳞茎具有润肺止咳，清热安神、解渴润燥、防癌抗癌等功效，对虚劳咳嗽，吐血，虚烦，惊悸，浮肿等病症有良好疗效，在众多方剂中得到广泛应用。山丹由于其极强的抗寒、抗旱和耐盐碱特性，是观赏和食用百合种质创新的重要抗性来源材料。山丹由于其良好的观赏和药用价值，近年来野生资源被大量采挖，加之自然更新能力较弱，种群破坏严重，一些地区山丹已濒临灭绝。山丹由于其鳞茎小、繁育难度大、原生环境复杂多样，并且病毒感染率极高，使得种源开发和资源异地保存举步维艰。组织培养技术作为山丹资源保存和后续种源产业化开发唯一有效的途径逐渐受到人们的重视，但传统组织培养通常需要大量采挖山丹地下鳞茎作为外植体，而山丹鳞茎生长的土壤中存在大量的微生物，以鳞片为外植体时，由于携带大量真菌或细菌，在进行初代培养时污染率极高，成功率很低，并且大量采挖山丹鳞茎作为外植体，会加剧对野生山丹资源的破坏。同时，以鳞片为外植体获得的再生后代不能脱除病毒，随着繁殖世代增加，病毒不断积累，给山丹资源保护和后续种源开发带来毁灭性影响。前人研究表明，植物种子一般是不携带病毒的，那么作为未成熟种子的胚珠也可以确定是没有感染病毒的。基于上述现状，开发简单易行、并且对野生资源不造成破坏的山丹脱毒组培技术势在必行。专利
技术实现思路
为了解决上述技术问题，本专利技术的目的是提供一种高效、低污染率的山丹脱毒快繁方法，本专利技术运用胚培养技术，以山丹授粉后充分膨大但尚未成熟的蒴果为材料，剥取蒴果内的胚珠（未成熟的种子），选择合适的培养基直接诱导形成初代无毒山丹试管苗。初代无毒山丹试管苗接种到合适的扩繁培养基上进行增殖。增殖后的试管苗转接到附加特定生长素的改良的MS培养基，在特定光周期下培育成重量不低于1g的大规格山丹试管生鳞茎。本专利技术提供的技术方案具体如下：一种山丹脱毒快繁方法，包括如下步骤：步骤（1）、蒴果取材：选取山丹授粉后充分膨大、尚未成熟发黄的蒴果，于低温条件运回实验室备用；步骤（2）、表面灭菌：将步骤（1）中获得的山丹蒴果用洗洁精水浸泡，冲洗干净，然后用酒精浸泡，再用次氯酸钠溶液浸泡，最后用无菌水冲洗若干次；步骤（3）、胚珠培养：将步骤（2）表面灭菌后的山丹蒴果吸干水分，然后纵向切开，选取蒴果中上部发育良好、肥厚充实的胚珠，接种到促进萌发培养基MS+NAA上，促进萌发培养基MS+NAA为MS+40-60g/L蔗糖+0.01-0.1mg/LNAA+6.5-7.0g/L琼脂粉，pH5.4-5.6；高温条件下高压灭菌15-20分钟；所有山丹试管苗均由胚珠中幼胚直接发育而来，不经愈伤组织和不定芽阶段，直接形成实生苗；步骤（4）、组培苗病毒检测：取胚珠培养获得的试管苗叶片，提取总RNA进行反转录，以反转录产物为模板，根据黄瓜花叶病毒、百合隐症病毒、百合斑驳病毒已经公布的外壳蛋白编码基因的序列设计引物，采用RT-PCR对试管苗进行病毒检测，扩增为阴性说明脱毒；步骤（5）、试管苗扩繁：步骤（5）中病毒检测为阴性的试管苗转接到扩繁培养基MS+KT+NAA，扩繁培养基MS+KT+NAA为MS+20-40g/L蔗糖+1.0-3.0mg/LKT+0.2-1mg/LNAA+6.5-7.0g/L琼脂粉，pH5.7-6.0，实现脱毒试管苗数量的增加；步骤（6）、试管鳞茎膨大及生根：脱毒试管苗扩繁到目标数量后，转接到试管鳞茎膨大及生根培养基。进一步地，步骤（2）中，用0.2-0.5%的洗洁精水浸泡10-20分钟，自来水下流水冲洗半小时以上；然后置于超净工作台上，先用浓度70-75%酒精浸泡60-100秒，并不断晃动，再用浓度1.5-2.5%的次氯酸钠溶液浸泡15-30分钟，期间不断晃动，最后用无菌水冲洗4-6次，每次不少于5分钟。进一步地，步骤（3）中，胚珠培养条件为：在温度25±1°C，光强12-20μmolm-2s-1条件下培养，每天10-16小时光照，8-14小时黑暗。进一步地，步骤（5）中，培养条件为：在温度25±1°C，光强30-36μmolm-2s-1条件下培养，每天10-16小时光照，8-14小时黑暗。进一步地，步骤（6）中，所述的小鳞茎膨大及生根培养基为改良MS培养基附加蔗糖40-50g/L、甘露醇20-30g/L和IAA0.3-1mg/L。进一步地，步骤（6）中，改良MS培养基成分及含量如表1所示：表1改良MS培养基成分及含量表我们收集授粉后充分膨大但尚未成熟的山丹蒴果，通过胚珠培养不但能够有效脱除病毒，获得大量脱毒山丹试管苗，而且污染率低，还不会对野生山丹造成破坏。组培小鳞茎的大小直接决定着山丹移栽成活率的高低，在组培过程中尽可能培育大规格的试管小鳞茎是保证山丹脱毒试管苗走向田间，实现规模化生产的关键因素。通过培养基主要营养元素、碳源、激素含量调整及光照条件优化，进行大规格山丹试管鳞茎培育。与现有技术相比，本专利技术的有益效果具体如下：（1）本专利技术以不携带病毒的山丹胚珠为培养材料，不经愈伤组织途径，直接诱导形成大量初代脱毒山丹试管苗，具有操作简单，培养周期短，脱毒率高等突出优点，从胚珠接种到萌发只需要40d左右的时间，脱毒率达到100%。同时，由于胚珠培养是由幼胚直接诱导形成完整植物，不容易引起基因变异。该过程以未成熟蒴果为外植体来源，无需采挖野生山丹鳞茎，避免对野生种群的破坏，也避免了以鳞片为外植体带来的严重的真菌及细菌污染问题，基本没有污染发生。（2）本专利技术进行胚珠培养时，通过适当增加蔗糖浓度，降低pH，使培养基的渗透压和pH更接近在蒴果中渗透压和pH，有利于胚珠萌发，萌发率达到95%以上，而采用常规蔗糖含量和pH值的培养基在相同激素含量和培养条件下萌发率仅为80%左右。（3）与正常培养光照强度和暗培养相比，本专利技术优化的光照强度能明显促进胚珠萌发，使胚珠萌发时间由50天以上缩短到40天左右，并且萌发率由70%左右增加到95%以上。（4）本专利技术以胚珠为外植体进行培养还具有如下有益效果：A、可以在短期内获得大量无毒试管苗。一株山丹一般可以形成4-5个硕果，平均每个蒴果可以剥取30-50个发育良好的胚珠，经40天左右的培养可以形成120-250个无毒试管苗，也就是说来源于一株山丹的胚珠经40天培养就可以获得120-250个无毒试管苗。而如果采用传统的茎尖培养脱毒，一株百合只能剥取一个茎尖，茎尖培养40-60天形成一块愈伤组织，愈伤组织经40-50天分化形成不超过10个再生试管苗，也就是说采用传统脱毒方式，一株百合经历80-100天才可获得不超过10个再生试管苗。B、脱毒效率高。以不感染病毒的胚珠为外植体，获得的试管苗100%是不感染病毒的。而采用传统茎尖培养脱毒技术，脱毒率一般不超过90%。C、污染率低。因为胚珠受到蒴果果皮的保护，不与外界接触，处于无菌状态，所以胚珠培养过程中污染率极低，接近零。而不管是茎尖培养还是鳞片培养，由于都源于鳞茎，而鳞茎与土壤密切接触，携带大量微生物本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种山丹脱毒快繁方法，其特征在于：包括如下步骤：步骤（1）、蒴果取材：选取山丹授粉后充分膨大、尚未成熟发黄的蒴果，于低温条件运回实验室备用；步骤（2）、表面灭菌：将步骤（1）中获得的山丹蒴果用洗洁精水浸泡，冲洗干净，然后用酒精浸泡，再用次氯酸钠溶液浸泡，最后用无菌水冲洗若干次；步骤（3）、胚珠培养：将步骤（2）表面灭菌后的山丹蒴果吸干水分，然后纵向切开，选取蒴果中上部发育良好、肥厚充实的胚珠，接种到促进萌发培养基MS+NAA上，促进萌发培养基MS+NAA为MS+40‑60g/L蔗糖+0.01‑0.1mg/L NAA+ 6.5‑7.0g/L琼脂粉，pH 5.4‑5.6；高温条件下高压灭菌15‑20分钟；步骤（4）、组培苗病毒检测：取胚珠培养获得的试管苗叶片，提取总RNA进行反转录，以反转录产物为模板，根据黄瓜花叶病毒、百合隐症病毒、百合斑驳病毒已经公布的外壳蛋白编码基因的序列设计引物，采用RT‑PCR对试管苗进行病毒检测，扩增为阴性说明脱毒；步骤（5）、试管苗扩繁：其中，病毒检测为阴性的试管苗转接到扩繁培养基MS+KT+NAA，扩繁培养基MS+KT+NAA为MS+20‑40g/L蔗糖+1.0‑3.0mg/L KT+0.2‑1mg/L NAA+ 6.5‑7.0g/L 琼脂粉，pH5.7‑6.0；步骤（6）、试管鳞茎膨大及生根：脱毒试管苗扩繁到目标数量后，转接到试管鳞茎膨大及生根培养基。...
【技术特征摘要】
1.一种山丹脱毒快繁方法，其特征在于：包括如下步骤：步骤（1）、蒴果取材：选取山丹授粉后充分膨大、尚未成熟发黄的蒴果，于低温条件运回实验室备用；步骤（2）、表面灭菌：将步骤（1）中获得的山丹蒴果用洗洁精水浸泡，冲洗干净，然后用酒精浸泡，再用次氯酸钠溶液浸泡，最后用无菌水冲洗若干次；步骤（3）、胚珠培养：将步骤（2）表面灭菌后的山丹蒴果吸干水分，然后纵向切开，选取蒴果中上部发育良好、肥厚充实的胚珠，接种到促进萌发培养基MS+NAA上，促进萌发培养基MS+NAA为MS+40-60g/L蔗糖+0.01-0.1mg/LNAA+6.5-7.0g/L琼脂粉，pH5.4-5.6；高温条件下高压灭菌15-20分钟；步骤（4）、组培苗病毒检测：取胚珠培养获得的试管苗叶片，提取总RNA进行反转录，以反转录产物为模板，根据黄瓜花叶病毒、百合隐症病毒、百合斑驳病毒已经公布的外壳蛋白编码基因的序列设计引物，采用RT-PCR对试管苗进行病毒检测，扩增为阴性说明脱毒；步骤（5）、试管苗扩繁：其中，病毒检测为阴性的试管苗转接到扩繁培养基MS+KT+NAA，扩繁培养基MS+KT+NAA为MS+20-40g/L蔗糖+1.0-3.0mg/LKT+0.2-1mg/LNAA+6.5-7.0g/L琼脂粉，pH5.7-6.0；步骤（6）、试管鳞茎膨大及生根：脱毒试管苗扩繁到目标数量后，转接到试管鳞茎膨大及生根培养基。2.根据权利要求1所述的山丹脱毒快繁方法，其特征在于：步骤（2）中，用0.2-0.5%的洗洁精水浸泡10-20分钟，自来水流水冲洗半小时以上；然后置于超净工作台上，先用浓度70-75%酒精浸泡60-100秒，...
【专利技术属性】
技术研发人员：王有国，张永称，张小平，徐柏林，刘金涛，
申请(专利权)人：云南农业大学，山丹县大黄山林场，
类型：发明
国别省市：云南,53
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