用于检测rs4986893的引物探针组及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种用于检测rs4986893的引物探针组及其应用。本发明专利技术首先保护一种引物探针组，由引物F、引物R和探针P组成；引物F为序列表的序列1所示的单链DNA分子；引物R为序列表的序列2所示的单链DNA分子；探针P为一个末端具有荧光基团且另一个末端具有荧光淬灭基团的单链DNA分子，且DNA分子中的部分核苷酸为锁核酸，DNA分子的核苷酸序列为序列表的序列3所示。本发明专利技术可用于检测rs4986893，判断待测样本基于该位点的基因型，从而指导用药，具有重大的应用推广价值。

【技术实现步骤摘要】
用于检测rs4986893的引物探针组及其应用
本专利技术涉及一种用于检测rs4986893的引物探针组及其应用。
技术介绍
细胞色素P450（CytochromeP450或CYP450,简称CYP450）代表着一个很大的可自身氧化的亚铁血红素蛋白家族，属于单氧酶的一类，因其在450纳米有特异吸收峰而得名。它参与内源性物质和包括药物、环境化合物在内的外源性物质的代谢。根据氨基酸序列的同源程度，其成员又依次分为家族、亚家族和酶个体三级。细胞色素P450酶系统可缩写为CYP，其中家族以阿拉伯数字表示，亚家族以大写英文字母表示，酶个体以阿拉伯数字表示，如CYP2D6、CYP2C19、CYP3A4等。人类肝细胞色素P450酶系中至少有9种P450与药物代谢相关。肝脏是人体重要的解毒器官，许多药物都经肝脏代谢，细胞色素P450是主要的肝细胞Ⅰ相代谢酶之一。在CYP2C亚家族中，CYP2C19亚型对药物反应起着关键性的作用，因为它们的活性存在显著的个体差异，表现为遗传多态性，可以使人产生血药浓度的显著个体差异。CYP2C19是CYP450酶第二亚家族中的重要成员，是人体重要的药物代谢酶，在肝脏中有很多表达。CYP2C19基因位于人类10号染色体上,cDNA全长1940bp,共编码490个氨基酸。CYP2C19具有很多SNP位点，至少存在14种突变基因和18种等位基因突变，主要包括CYP2C19*1，CYP2C19*2，CYP2C19*3，CYP2C19*17。编码正常酶活性的基因是CYP2C19*1。CYP2C19*2和CYP2C19*3等位基因占东方人弱代谢表型(PM)的99％以上，其编码的酶无活性。CYP2C19*3等位基因是在外显子4第636位发生G→A突变，产生了提前的终止密码，蛋白合成终止，使CYP2C19酶活性丧失。通过该酶代谢的药物（如质子泵抑制剂，抗惊厥药等）随患者基因型不同，其疗效和副作用也有明显不同。根据CYP2C19基因基因型,人群中对药物氧化代谢能力可分为2种表型,一种为强代谢者(extensivemetabolizer,EM),另一种为弱代谢者(poormetabolizer,PM)。正常人群对某一类药物的代谢一般表现为强代谢,弱代谢则主要是由于2个等位基因的突变和(或)缺失引起的表型改变。由于不同个体存在药物代谢方面的差异,因而给药后可能会出现严重的毒副作用或药物剂量不足,从而导致治疗的失败。CYP2C19主要参与代谢的药物谱也较为广泛,其大致有质子泵抑制剂、三环类抗抑郁药、抗癫痫药、抗精神病药、降糖药、抗凝药、抗疟疾药以及一些抗癌药物等。CYP2C19的遗传多态性影响着许多临床药物的代谢,其活性存在明显的个体差异,对不同个体的药物治疗作用和不良反应及药物的毒性具有重要影响。据统计，CYP2C19*2和CYP2C19*3两个突变位点能解释几乎100%的东亚人和85%的高加索人种的相关弱代谢遗传缺陷，CYP2C19*2和CYP2C19*3在亚洲发生突变的频率较高,在中国人群中约占30%,与药物代谢关系最为密切。加强对CYP2CI9基因多态性的研究，有助于提高对个体肿瘤易感性的预测水平,预防和减少肿瘤的发生。通过对CYP2C19酶研究的不断深入，了解更多药物受CYP2CI9酶基因多态性的影响及药物之间的相互作用，明确CYP2CI9酶与肿瘤等疾病发生的相关性，对指导临床合理用药，提高肿瘤等疾病的预测水平有重要意义。故进一步开展CYP2C19酶的相关研究有重要的临床价值和实践意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种用于检测rs4986893的引物探针组及其应用。本专利技术首先保护一种引物探针组，由引物F、引物R和探针P组成；引物F为如下（a1）或（a2）：（a1）序列表的序列1所示的单链DNA分子；（a2）将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子；引物R为如下（b1）或（b2）：（b1）序列表的序列2所示的单链DNA分子；（b2）将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子；探针P为一个末端具有荧光基团且另一个末端具有荧光淬灭基团的单链DNA分子，且DNA分子中的部分核苷酸为锁核酸，DNA分子的核苷酸序列为如下（c1）或（c2）：（c1）序列表的序列3所示；（c2）将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加。探针P为5’末端具有HEX荧光基团且3’末端具有BHQ1荧光淬灭基团的单链DNA分子。具体来说，所述探针P的核苷酸序列如序列表的序列3所示，且第1-3位核苷酸和第28-30位核苷酸均为锁核酸。所述引物探针组中，引物F、引物R、探针P的摩尔配比为：10：2.5：10。本专利技术还保护所述引物探针组在制备用于检测rs4986893的试剂盒中的应用。本专利技术还保护一种用于检测rs4986893的试剂盒，包括所述引物探针组。本专利技术还保护组件甲和组件乙在制备用于检测rs4986893的试剂盒中的应用；组件甲为所述引物探针组；组件乙为试剂或试剂组合，组件乙的功能为用血液样本制备用于荧光定量PCR的模板样本。组件乙包括裂解液。所述裂解液为1.5-2g/100ml的NaCl水溶液，具体可为1.7g/100ml的NaCl水溶液。组件乙还包括保存液。保存液的制备方法：①将25体积份FG缓冲液和4体积份蛋白酶K溶液混合，得到混合液；②将1体积份步骤①得到的混合液与5体积份ddH2O混合，得到保存液。本专利技术还保护一种用于检测rs4986893的试剂盒，包括组件甲和组件乙；组件甲为所述引物探针组；组件乙为试剂或试剂组合，组件乙的功能为用血液样本制备用于荧光定量PCR的模板样本。组件乙包括裂解液。所述裂解液为1.5-2g/100ml的NaCl水溶液，具体可为1.7g/100ml的NaCl水溶液。组件乙还包括保存液。保存液的制备方法：①将25体积份FG缓冲液和4体积份蛋白酶K溶液混合，得到混合液；②将1体积份步骤①得到的混合液与5体积份ddH2O混合，得到保存液。本专利技术还保护一种试剂盒，包括裂解液。所述试剂盒的功能为用血液样本制备用于荧光定量PCR的模板样本。所述裂解液为1.5-2g/100ml的NaCl水溶液，具体可为1.7g/100ml的NaCl水溶液。所述试剂盒还包括保存液。保存液的制备方法：①将25体积份FG缓冲液和4体积份蛋白酶K溶液混合，得到混合液；②将1体积份步骤①得到的混合液与5体积份ddH2O混合，得到保存液。本专利技术还保护一种用血液样本制备用于荧光定量PCR的模板样本的方法，包括如下步骤：（1）取抗凝血，加入所述裂解液，颠倒混匀，离心弃上清；（2）完成步骤（1）后，加入所述保存液，先60-70℃（具体可为65℃）水浴，再80-90℃（具体可为85℃）水浴，然后离心，使用时取上清，即为模板样本。所述用血液样本制备用于荧光定量PCR的模板样本的方法，具体包括如下步骤：（1）取65μLEDTA抗凝血，加入500μL所述裂解液，颠倒混匀，12000rpm离心4min，弃上清；（2）完成步骤（1）后，加入120μL所述保存液，先65℃水浴10min，再85℃水浴10min，然后12000rpm离心4min，然本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.引物探针组，由引物F、引物R和探针P组成；引物F为如下（a1）或（a2）：（a1）序列表的序列1所示的单链DNA分子；（a2）将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子；引物R为如下（b1）或（b2）：（b1）序列表的序列2所示的单链DNA分子；（b2）将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子；探针P为一个末端具有荧光基团且另一个末端具有荧光淬灭基团的单链DNA分子，且DNA分子中的部分核苷酸为锁核酸，DNA分子的核苷酸序列为如下（c1）或（c2）：（c1）序列表的序列3所示；（c2）将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加。

【技术特征摘要】
1.引物探针组，由引物F、引物R和探针P组成；引物F为如下（a1）或（a2）：（a1）序列表的序列1所示的单链DNA分子；（a2）将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子；引物R为如下（b1）或（b2）：（b1）序列表的序列2所示的单链DNA分子；（b2）将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子；探针P为一个末端具有荧光基团且另一个末端具有荧光淬灭基团的单链DNA分子，且DNA分子中的部分核苷酸为锁核酸，DNA分子的核苷酸序列为如下（c1）或（c2）：（c1）序列表的序列3所示；（c2）将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加。2.如权利要求1所述的引物探针组，其特征在于：所述探针P的核苷酸序列如序列表的序列3所示，且第1-3位核苷酸和第28-30位核苷酸均为锁核酸。3.权利要求1或2所述引物探针组在制备用于检测rs4986893的试剂盒中的应用。4.一种用于检测rs4986893的试剂盒，包括权利要求1或2所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：丛茜，刘婷婷，李朋，赵海文，逄钊，郑焕霞，
申请(专利权)人：山东德诺生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37