一种用于定量分析CHO宿主细胞DNA残留的序列、引物及方法技术

本发明专利技术提供了一种用于定量分析CHO宿主细胞DNA残留的序列、引物、探针及方法。本发明专利技术在分析CHO细胞核酸重复序列的基础上，选择了一系列高度重复序列作为定量分析基因，使用Taqman探针法qPCR技术将检测灵敏度大大提高2个数量级(5pg/mL)，且在DNA浓度在5pg～50000ng/mL时有良好的线性范围(R

A Sequence, Primer and Method for Quantitative Analysis of DNA Residues in CHO Host Cells

The invention provides a sequence, primer, probe and method for quantitative analysis of DNA residues in CHO host cells. Based on the analysis of nucleic acid repeat sequences of CHO cells, a series of highly repetitive sequences are selected as quantitative analysis genes. The detection sensitivity is greatly improved by two orders of magnitude (5pg/mL) by using Taqman probe qPCR technology, and the detection has a good linear range (R) when DNA concentration is between 5pg and 50000ng/mL.

【技术实现步骤摘要】
一种用于定量分析CHO宿主细胞DNA残留的序列、引物及方法
本专利技术属于生物
，具体涉及一种用于定量分析CHO宿主细胞DNA残留的序列、引物、探针及方法。
技术介绍
在现代的生产工艺中，依赖于重组蛋白载体来生产生物制剂已经成为主流技术，CHO细胞作为常用的宿主细胞系用于生产生物制剂，而蛋白产品中含有残留的宿主细胞DNA是潜在的安全隐患，因此蛋白制品中DNA残留的多少是生产所必须严格把控的。为确保生产的生物制品的质量，美国FDA(FoodandDrugAdministration)在1997年发布的指导原则中规定，最终产品中宿主细胞DNA残留量不得高于100pg/dose；曾经，对于非肠道给药的最终产品中宿主细胞DNA残留量WHO(WorldHealthOrganization)公布的相关标准是不得高于100pg/dose，但1998年这一标准修改为不高于10ng/dose；EU(EuropeanUnion)，2001年公布的相关标准也是最终产品中宿主细胞DNA残留量不得高于10ng/dose；《中国药典》三部2010年版规定原核表达的生物制品其DNA残留量不高于10ng/dose，真核细胞表达的产品的DNA残留量应不高于100pg/dose。目前2010版《中国药典》中收录的了检测外源DNA残留量的方法有DNA杂交法和荧光染料法。DNA杂交法需要的条件相对简单，但该方法存在时间长，操作繁琐，稳定性、敏感性、特异性较差等缺点；荧光染料法是利用PicoGreen这种高灵敏度的双链DNA荧光染料对DNA含量进行定量测定。该方法的检验灵敏度可达300pg/mL，但良好的线性范围在DNA1.25～80ng/mL(R2≥0.99)，同时，该方法缺点为容易受到RNA、ssDNA、dsDNA的干扰。另一方面，针对生物制品成品中宿主细胞DNA残留量(10-1000pg/mL)往往低于有效的线性范围DNA(1.25～80ng/mL)，所以目前尚存在生物制品成品中DNA残留无法准确定量的问题。
技术实现思路
为了解决现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种用于定量分析CHO宿主细胞DNA残留的序列、引物、探针及方法。本专利技术在分析CHO细胞核酸重复序列的基础上，选择了一系列高度重复序列作为定量分析基因，使用Taqman探针法qPCR技术将检测灵敏度大大提高2个数量级(5pg/mL)，且在DNA浓度在5pg～50000ng/mL时有良好的线性范围(R2≥0.99)。本专利技术的目的是提供一种用于定量分析CHO宿主细胞DNA残留的序列。本专利技术的再一目的是提供所述序列的引物。本专利技术的再一目的是提供所述引物的探针。本专利技术的再一目的是提供一种定量分析CHO宿主细胞DNA残留的方法。根据本专利技术的用于定量分析CHO宿主细胞DNA残留的序列，所述序列包括序列a、序列b、序列c、序列d、序列e、序列f、序列g、序列h、序列i和序列j中的任意一个或多个；所述序列a的序列如SEQIDNO：1所示，所述序列b的序列如SEQIDNO：2所示，所述序列c的序列如SEQIDNO：3所示，所述序列d的序列如SEQIDNO：4所示，所述序列e的序列如SEQIDNO：5所示，所述序列f的序列如SEQIDNO：6所示，所述序列g的序列如SEQIDNO：7所示，所述序列h的序列如SEQIDNO：8所示。其中，SEQIDNO：1为：TGCCTTACAGAGGCCCCCATGTCTTACAGAGGCCTCCATGTCCTACAGAGGCCCCCATGTCCTTCAGAGGTCCTCATGTTCTACAGAGGCTCCCTTGTCTTACAGAGGCTCCCCTGTCTTACAGAGGCCCCCA；SEQIDNO：2为：GTCGTGGGAAAGGGAAGGAAGAGTGACCTGTACCCAGATTCAGGGAGCTCCTCCCTGCCTGGGCGTGTCTACTCCAAGCATGCACAAGCCTGGGGAGATCTGCGTGAATGGCGCTTTGGACAGGAGTTGGGTAAGAACAGGGAGTCACTCACCTCGTTGTGATCT；SEQIDNO：3为：CCCTTTCCGTGGACTCATCGCAGACCAGGTGAGCCACCCCCTGCTTTTACCCAATTCTTGTCCTAAGCGCCATCCACCCAGATCCCTCCAGGCTCGTCCCTGCTTGAAACAGACACGCCCAGGTAGGGTGGAGCTTCCTGAATCTGGCTTGGTTCAGGACACTCTTCCTT；SEQIDNO：4为：CGGAAAGGGAAGGAAGAGTGTCCTGAACCAAGCCAGATTCAGGAAGCTCCACCCTACCTGGGCGTGTCTGTTTCAAGCAGGGACGAGCCTGGAGGGATCTGGGTGGATGGCGCTTAGGACAAGAATTGGGTAAAAGCAGGGGGTGGCTCACCTGGTCTGCGATGAGTCCA；SEQIDNO：5为：AGCCAGATTCAGGAAGCTCCACCCTACCTGGGCGTGTCTGTTTCAAGCAGGGACGAGCCTGGAGGGATCTGGGTGGATGGCGCTTAGGACAAGAATTGGGTAAAAGCAGGGGGTGGCTCACCTGGTCTGCGATGAGTCCACGGAAAGGGAAGGAAGAGTGTCCTGAACCA；SEQIDNO：6为：GCTTCCTGAATCTGGCTTGGTTCAGGACACTCTTCCTTCCCTTTCCGTGGACTCATCGCAGACCAGGTGAGCCACCCCCTGCTTTTACCCAATTCTTGTCCTAAGCGCCATCCACCCAGATCCCTCCAGGCTCGTCCCTGCTTGAAACAGACACGCCCAGGTAGGGTGGA；SEQIDNO：7为：GGTTGGTCCAGAGAGCTGGTTGATCCAGGCAGCTGGTTGGTCCTGGGAGCTGGGTGGTCCAGGGAGCTGGTTGGCCCAGGCATCTGGTTGGTCCTGGTAGCTAGTTGGTCTAGGGAGCTGGTTTGTCCAGGGAGCTGGTTGGTCCTGGAAGCTGGTTGGTCCAGGCAGCTGGTTGGCCCAGGAAGCTGATGATCCTGACTGCCCATAACAAAGCA；SEQIDNO：8为：TGTGTATGAGTTCATGTGTATAGATTTCACAGCAGAGATTTAAAAATAATCATGTCGCAGCCACAGAAAGAGAAGACATAAGTGTTGGAATCTAGTGTGCTTTAATAGTGAAATCGCAGCACACACACACACACACACACTCACACACACACACACACAGGAAGTTTAAACTAAGTAGTTTATTTCTTTAGGAAACTACAACCTCTTTTCCTTCTCCCTCTTCTGTGTGG。根据本专利技术所述的序列对应的引物，其中，所述引物包含分别对应序列a、序列b、序列c、序列d、序列e、序列f、序列g和序列h的序列a引物F、序列a引物R、序列b引物F、序列b引物本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于定量分析CHO宿主细胞DNA残留的序列，其特征在于，所述序列包括序列a、序列b、序列c、序列d、序列e、序列f、序列g、序列h、序列i和序列j中的任意一个或多个；所述序列a的序列如SEQ ID NO：1所示，所述序列b的序列如SEQ ID NO：2所示，所述序列c的序列如SEQ ID NO：3所示，所述序列d的序列如SEQ ID NO：4所示，所述序列e的序列如SEQ ID NO：5所示，所述序列f的序列如SEQ ID NO：6所示，所述序列g的序列如SEQ ID NO：7所示，所述序列h的序列如SEQ ID NO：8所示。

【技术特征摘要】
1.一种用于定量分析CHO宿主细胞DNA残留的序列，其特征在于，所述序列包括序列a、序列b、序列c、序列d、序列e、序列f、序列g、序列h、序列i和序列j中的任意一个或多个；所述序列a的序列如SEQIDNO：1所示，所述序列b的序列如SEQIDNO：2所示，所述序列c的序列如SEQIDNO：3所示，所述序列d的序列如SEQIDNO：4所示，所述序列e的序列如SEQIDNO：5所示，所述序列f的序列如SEQIDNO：6所示，所述序列g的序列如SEQIDNO：7所示，所述序列h的序列如SEQIDNO：8所示。2.权利要求1所述的序列对应的引物，其特征在于，所述引物包含分别对应序列a、序列b、序列c、序列d、序列e、序列f、序列g和序列h的序列a引物F、序列a引物R、序列b引物F、序列b引物R、序列c引物F、序列c引物R、序列d引物F、序列d引物R、序列e引物F、序列e引物R、序列f引物F、序列f引物R、序列g引物F、序列g引物R、序列h引物F、序列h引物R中的任意一组或多组；所述序列a引物F的序列如SEQIDNO：9所示，所述序列a引物R的序列如SEQIDNO：10所示，所述序列b引物F的序列如SEQIDNO：11所示，所述序列b引物R的序列如SEQIDNO：12所示，所述序列c引物F的序列如SEQIDNO：13所示，所述序列c引物R的序列如SEQIDNO：14所示，所述序列d引物F的序列如SEQIDNO：15所示，所述序列d引物R的序列如SEQIDNO：16所示，所述序列e引物F的序列如SEQIDNO：17所示，所述序列e引物R的序列如SEQIDNO：18所示，所述序列f引物F的序列如SEQIDNO：19所示，所述序列f引物R的序列如SEQIDNO：20所示，所述序列g引物F的序列如SEQIDNO：21所示，所述序列g引物R的序列如SEQIDNO：22所示，所述序列h引物F的序列如SEQIDNO：23所示，所述序列h引物R的序列如SEQIDNO：24所示。3.权利要求1所述的序列对应的探针，其特征在于，所述探针包括分别对应序列a、序列b、序列c、序列d、序列e、序列f、序列g和序列h的序列a探针、序列b探针、序列c探针、序列d探针、序列e探针、序列f探针、序列g探针和序列h探针；所述序列a探针的序列如SEQIDNO：25所示，所述序列b探针的序列如SEQIDNO：26所示，所述序列c探针的序列如SEQIDNO：27所示，所述序列d探针的序列如SEQIDNO：28所示，所述序列e探针的序列如SEQIDNO：29所示，所述序列f探针的序列...

【专利技术属性】
技术研发人员：董先辉，王晓香，陈存款，张娟，钟健翔，
申请(专利权)人：广州七谱生物医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44