单链寡核苷酸的制备方法技术

本发明专利技术涉及一种单链寡核苷酸的制备方法，首先进行PEAR反应，模板为N’‑X’‑R’‑N’‑X’，R’为能产生3’突出末端的耐高温限制性内切酶的识别位点，N’为切刻内切酶的识别位点，经过高温变性、退火、延伸，得到延伸产物双链N’‑X’‑R’‑N’‑X’/N‑X‑R‑N‑X；利用能产生3’突出末端的限制性内切酶对双链进行切割，得到片段(N‑X/N’‑X’)；没有被酶切的双链作为模板直接参与下一轮的扩增，而且模板在退火过程中通过滑动作用而继续延伸，串联重复序列增加，目的产物持续指数增长。然后进行切口引物延伸反应，切刻内切酶对PEAR酶切产物中的N‑X链进行切割，产生单链缺口，另外一条单链保持完整，随后聚合酶以缺口为起点进行延伸，切刻内切酶识别位点重新形成；同时通过置换下游的目的单链X，得到游离的单链。

【技术实现步骤摘要】
单链寡核苷酸的制备方法
本专利技术属于寡核苷酸的合成
，具体涉及一种单链寡核苷酸的制备方法。
技术介绍
单链寡核苷酸通常是指一条单链DNA、RNA或其他修饰核酸，其长度一般为20～60nt。根据碱基互补配对原则，寡核苷酸能够与靶序列特异性的形成互补双链结构，体现出重要的生理功能，并且在食品安全检测、临床诊断以及药物治疗等领域也具有广泛的应用。随着寡核苷酸需求量的日益增加，一些领域对寡核苷酸的纯度要求很高。目前，寡核苷酸的制备方式主要有两种，一种是化学合成，另一种是酶法制备。化学合成方法是利用DNA合成仪进行固相合成，合成规模难以扩大，合成量有限；固相合成制备的产物纯化较为困难；设备及原料成本偏高；使用大量的有机试剂，产生有机废料。酶法制备是以核酸聚合酶及dNTPs(或NTPs，修饰dNTPs等)为原料，通过各种酶促反应来获得寡核苷酸。与化学合成相比，酶法制备具有不使用有毒试剂、合成效率高、保真性好等优点，具有良好的发展前景。目前最有效的酶法合成方法为聚合酶内切酶扩增技术(polymeraseendo-nucleaseamplificationreaction，PEAR)，是以一段带有2个串联重复的寡核苷酸(用X’R’X’表示)序列作为模板，中间的R’为限制性内切酶的识别位点序列，并根据寡核苷酸的序列组成设计相应的反义探针(X)，通过变性、退火、延伸以及切割等几个步骤，完成对寡核苷酸的制备。如图1所示，PEAR技术的基本原理为：首先高温变性，使模板与其反义探针处于单链的状态，在退火的温度条件下，模板与反义探针结合，当探针结合到模板的3’端时，探针在聚合酶的作用下进行延伸，延伸产物为双链DNA；由于产物中带有限制性内切酶的识别位点，延伸得到的双链被内切酶酶切，得到较短的片段(X/X’)。在下一轮变性退火过程中，酶切的小片段也可以作为引物进行延伸反应；同时由于酶切不完全，没有被酶切双链产物会作为模板直接参与下一轮的扩增，而且模板在退火过程中通过滑动作用而继续延伸，串联重复序列增加，周而复始，实现目的产物的持续指数增长，即图1中右边的循环过程。PEAR作为一种新型的合成寡核苷酸的方法，能够快速、准确、简单的扩增寡核苷酸，但由于PEAR反应为制备寡核苷酸双链的技术，难以制备具有生物学活性的寡核苷酸单链，使其应用得到限制；此外，由于PEAR扩增产物不可避免地带有限制性内切酶的酶切位点，如图2所示，使制备的寡核苷酸序列受到极大的限制。因此，开发一种新型的基于PEAR技术的寡核苷酸单链制备技术尤为重要。
技术实现思路
针对现有的PEAR反应产物为双链寡核苷酸，且制备的产物带有酶切位点，后续反应去除比较繁琐的问题，本专利技术旨在提供一种单链寡核苷酸的制备方法，该方法利用产生3’突出末端的限制性内切酶(如TspRI)得到的产物进行PEAR扩增得到特异性的扩增产物；利用切刻内切酶(如Nt.BstNBI)对PEAR的扩增产物进行切刻，聚合酶以缺口为起点进行延伸，同时通过置换下游的寡核苷酸链，得到游离的单链。该方法能够制得大量的特异性的单链寡核苷酸。本专利技术是通过以下技术方案实现的：一种单链寡核苷酸的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)设计模板N’-X’-R’-N’-X’，R’为能产生3’突出末端的耐高温限制性内切酶的识别位点，N’为切刻内切酶的识别位点，X’为目的单链X的互补序列；(2)PEAR反应：模板经过高温变性、退火、延伸，得到延伸产物双链N’-X’-R’-N’-X’/N-X-R-N-X；利用能产生3’突出末端的限制性内切酶对双链进行切割，得到较短的片段(N’-X’/N-X)，该片段单链带有3’端突出的粘性末端；由于酶切不完全，没有被酶切的双链作为模板直接参与下一轮的扩增，而且模板在退火过程中通过滑动作用而继续延伸，串联重复序列增加，周而复始，实现目的产物的持续指数增长；(3)切口引物延伸反应：对PEAR酶切产物进行纯化，切刻内切酶对PEAR酶切产物中的N-X链进行切割，产生单链缺口，另外一条单链保持完整，随后聚合酶以缺口为起点进行延伸，切刻内切酶识别位点重新形成；同时通过置换下游的目的单链X，得到游离的单链。所述能产生3’粘性末端的耐高温限制性内切酶包括但不限于BsiHKAI，BsLI，KpnI，KpnI-HF，PstI-HF，TspRI，优选TspRI。所述切刻内切酶包括但不限于Nt.BbvCI，Nt.BsmAI，Nt.BspQI，Nt.BstNBI，Nb.BvCI，Nb.BsmI，Nb.BsrDI，Nb.BtsI，优选Nt.BstNBI。所述步骤(2)的PEAR延伸反应，模板的浓度为10nM-1uM，优选100nM；所述聚合酶为适用于PCR反应的耐热DNA聚合酶，包括但不限于PhusionHotStartFlexDNA聚合酶、OneTaqDNA聚合酶、TaqDNA聚合酶、Vent(exo-)DNA聚合酶、DeepVent(exo-)DNA聚合酶，优选Vent(exo-)DNA聚合酶；聚合酶浓度为0.02-0.06U/μL，优选0.04U/μL；循环数为10-30个，其中优选30个循环；每个循环反应时间为3-10min，其中优选5min。所述步骤(2)的限制性内切酶酶切反应，限制性内切酶的浓度为0.025-0.2U/μL，优选浓度为0.04U/μL。所述步骤(3)切刻内切酶酶切反应，切刻内切酶包括但不限于Nt.BbvCI，Nt.BsmAI，Nt.BspQI，Nt.BstNBI，Nb.BvCI，Nb.BsmI，Nb.BsrDI，Nb.BtsI，优选Nt.BstNBI；酶浓度为0.08-0.8U/μL，优选0.8U/μL；反应时间为1-30min，优选5min；温度为45-60℃，优选55℃。所述步骤(3)切口延伸反应，聚合酶为具有链置换活性的DNA聚合酶，包括但不限于Bst2.0DNA聚合酶、VentDNA聚合酶、Vent(exo-)DNA聚合酶、DeepVentDNA聚合酶、DeepVent(exo-)DNA聚合酶、phi29DNA聚合酶，优选Bst2.0DNA聚合酶；酶浓度为0.08-0.8U/μL，优选0.32U/μL。本专利技术的有益效果：(1)本专利技术采用能产生3’突出末端的限制性内切酶进行PEAR扩增，PEAR扩增产物带有3’端突出的粘性末端，避免高温中与聚合酶的进一步反应，产生非特异性的扩增产物；(2)PEAR的扩增产物经完全酶切后可直接用于切口引物延伸反应，酶切产物中带有切刻内切酶的识别位点，切刻内切酶识别产物中的酶切位点产生缺口，随后聚合酶以缺口为起点进行延伸，同时通过置换下游的DNA链，得到游离的单链；这一聚合延伸反应使切刻内切酶的识别位点重新形成，使酶切-延伸的过程反复进行，从而可以直接产生大量的目的单链；无需外切酶酶切、连接酶连接等步骤，简化了反应过程。(3)本专利技术实现了简单条件下的快速大量扩增，反应时间短，5分钟即可获得大量的目的产物；通过酶切的方法验证产物具有特异性。(4)本专利技术通过改变目的产物的序列，成功制备了多种长度、不同碱基的目的反义寡核苷酸，说明本方法具有通用性，可广泛用于合成反义寡核苷酸。附图说明图1为PEAR反应的原理图。图2为PEAR酶切产物结构示意图；图中1为目的单链本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种单链寡核苷酸的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)设计模板N’‑X’‑R’‑N’‑X’，R’为能产生3’突出末端的耐高温限制性内切酶的识别位点，N’为切刻内切酶的识别位点，X’为目的单链X的互补序列；(2)PEAR反应：模板经过高温变性、退火、延伸，得到延伸产物双链N’‑X’‑R’‑N’‑X’/N‑X‑R‑N‑X；利用能产生3’突出末端的限制性内切酶对双链进行切割，得到较短的片段(N’‑X’/N‑X)，该片段单链带有3’端突出的粘性末端；由于酶切不完全，没有被酶切的双链作为模板直接参与下一轮的扩增，而且模板在退火过程中通过滑动作用而继续延伸，串联重复序列增加，周而复始，实现目的产物的持续指数增长；(3)切口引物延伸反应：对PEAR酶切产物进行纯化，切刻内切酶对PEAR酶切产物中的N‑X链进行切割，产生单链缺口，另外一条单链保持完整，随后聚合酶以缺口为起点进行延伸，切刻内切酶识别位点重新形成；同时通过置换下游的目的单链X，得到游离的单链。

【技术特征摘要】
1.一种单链寡核苷酸的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)设计模板N’-X’-R’-N’-X’，R’为能产生3’突出末端的耐高温限制性内切酶的识别位点，N’为切刻内切酶的识别位点，X’为目的单链X的互补序列；(2)PEAR反应：模板经过高温变性、退火、延伸，得到延伸产物双链N’-X’-R’-N’-X’/N-X-R-N-X；利用能产生3’突出末端的限制性内切酶对双链进行切割，得到较短的片段(N’-X’/N-X)，该片段单链带有3’端突出的粘性末端；由于酶切不完全，没有被酶切的双链作为模板直接参与下一轮的扩增，而且模板在退火过程中通过滑动作用而继续延伸，串联重复序列增加，周而复始，实现目的产物的持续指数增长；(3)切口引物延伸反应：对PEAR酶切产物进行纯化，切刻内切酶对PEAR酶切产物中的N-X链进行切割，产生单链缺口，另外一条单链保持完整，随后聚合酶以缺口为起点进行延伸，切刻内切酶识别位点重新形成；同时通过置换下游的目的单链X，得到游离的单链。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中能产生3’粘性末端的耐高温限制性内切酶为BsiHKAI，BsLI，KpnI，KpnI-HF，PstI-HF或者TspRI。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中切刻内切酶为Nt.BbvCI，Nt.BsmAI，Nt.BspQI，Nt.BstNBI，Nb.BvCI，Nb.BsmI，Nb.BsrDI或者Nb.BtsI。4.根据权利要求1-3任一项所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)的PEAR延伸反应，模板的浓度为10nM-1uM，聚合酶为适用于PCR反应的耐热DNA聚合酶，其浓度为0.02-0.06U/μL，循环数为10-30...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁兴国，曹娟娟，安然，
申请(专利权)人：中国海洋大学，
类型：发明
国别省市：山东,37