一种莫纳可林J异源生产的方法及应用技术

本发明专利技术涉及一种异源生产莫纳可林J的毕赤酵母工程菌的改造及应用。本发明专利技术中，通过基因重组技术对酵母工程菌株进行优化改造，获得可生产莫纳可林J或其中间产物二氢莫纳可林L的酵母工程菌。所述酵母工程菌的目的产物产量显著增加，为工业生产莫纳可林J及其下游产物提供了新的途径。

【技术实现步骤摘要】
一种莫纳可林J异源生产的方法及应用
本专利技术属于生物工程领域；更具体的，本专利技术涉及一种异源生产莫纳可林J的毕赤酵母工程菌的改造及应用。
技术介绍
辛伐他汀是人工半合成药物，因其对人体内胆固醇生物合成有明显抑制作用而被作为降血脂药物广泛使用。目前，工业生产辛伐他汀主要源于前体莫纳可林J的生物法或化学法转化，而莫纳可林J的工业获得源于土曲霉发酵产物洛伐他汀的水解。在该辛伐他汀生产过程中，莫纳可林J可以经酶催化一步转化为辛伐他汀，而水解洛伐他汀得到莫纳可林J的过程为全化学法水解，步骤较复杂、副产物多且需要引入催化剂。使用微生物底盘细胞进行一步法异源合成莫纳可林J，能够替代化学水解法，避免以上问题，为莫纳可林J及辛伐他汀的工业生产提供新的方法。毕赤酵母(Pichiapastoris)是优良的微生物底盘细胞，因其能够表达广泛的重组蛋白而受到广泛关注，作为一个公认安全的微生物已经被用来成功表达了超过1000多个重组蛋白。毕赤酵母能够在成分确定的培养基中快速生长到高密度，具有进行复杂蛋白翻译后修饰功能以指导蛋白正确折叠。除此之外，毕赤酵母是天然的甲基营养性微生物，它能够在甲醇为唯一碳源的条件下生长到高密度、甲醇代谢能力强。甲醇是煤化工行业的副产物，可由天然气合成，也可以通过空气中的二氧化碳进行还原而得到，而甲醇相比常用的发酵型糖类，其还原力更强，能够为异源产物的合成提供更多的驱动力。甲醇这种大体量、低价格、可再生的特点促使其逐步发展成为生物化学衍生产品的良好原料。同时毕赤酵母已有成熟配套的异源表达载体，针对毕赤酵母的转化、筛选以及规模放大的研究已经开展多年，毕赤酵母可以作为一个良好的底盘细胞用来合成生产高附加值生物制品。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种以乙醇为底物的通过重组酵母工程菌混合共培养，以异源合成莫纳可林J的方法。在本专利技术的第一方面，提供一种二氢莫纳可林L的异源生产方法，包括：(1)提供酵母工程菌，使其表达外源的下组基因的表达盒：lovB，lovC，lovG，npgA，并以乙醇诱导型启动子驱动表达转录激活因子uta；(2)以乙醇作为碳源、前体和/或诱导剂，培养(1)的酵母工程菌，从而生成产物二氢莫纳可林L。在本专利技术的另一方面，提供一种莫纳可林J的异源生产方法，包括：(a)提供酵母工程菌，使其表达外源的下组基因的表达盒：lovB，lovC，lovG，npgA，并以乙醇诱导型启动子驱动表达转录激活因子uta；(b)提供酵母工程菌，使其表达外源的下组基因的表达盒：lovA，cpr，并以乙醇诱导型启动子驱动表达转录激活因子uta；(c)以乙醇作为碳源、前体和/或诱导剂，培养(a)和(b)的酵母工程菌的混合菌，从而生成产物莫纳可林J。在一个优选例中，(1)或(a)中，所述的酵母工程菌还表达外源的乙醇脱氢酶ADH、乙酰辅酶A合成酶ACS和乙酰辅酶A脱羧酶ACC。在另一优选例中，(1)或(a)中，以PAOX1R作为驱动lovB，lovC，lovG，npgA表达的启动子；或(b)中，以PAOX1R作为驱动lovA，cpr表达的启动子；或(1)或(a)或(b)中，以PICL1为乙醇诱导型启动子。在另一优选例中，(c)中，(a)和(b)的酵母工程菌的混合菌中，(a)菌:(b)菌的比例为1:0.1～1；优选地为1:0.2～0.5(菌群中两种酵母细胞的数量之比)；或，步骤(2)或(c)中，以添加乙醇(添加0.2～1％；较佳地0.3～0.8％；更佳地0.4～0.6％)的酵母基础氮源培养基进行培养，在发酵前期使用葡萄糖作为碳源进行补料；在菌体湿重达到200～400g/L(较佳地250～350g/L；更佳地280～320g/L)后，之后切换碳源至乙醇补料。在另一优选例中，所述的基因lovB，lovC，lovG，npgA，lovA，cpr来源于土曲霉。在另一优选例中，所述的lovB基因具有SEQIDNO:1所示的核苷酸序列，或其简并序列，或与SEQIDNO:1序列有70％以上(较佳地80％以上；更佳地90％以上；更佳的93％以上；更佳地95％以上；更佳的97％以上，如98％～99％)相同性的编码同功能蛋白的核苷酸序列。在另一优选例中，所述的lovC基因具有SEQIDNO:2所示的核苷酸序列，或其简并序列，或与SEQIDNO:2序列有70％以上(较佳地80％以上；更佳地90％以上；更佳的93％以上；更佳地95％以上；更佳的97％以上，如98％～99％)相同性的编码同功能蛋白的核苷酸序列。在另一优选例中，所述的lovG基因具有SEQIDNO:3所示的核苷酸序列，或其简并序列，或与SEQIDNO:3序列有70％以上(较佳地80％以上；更佳地90％以上；更佳的93％以上；更佳地95％以上；更佳的97％以上，如98％～99％)相同性的编码同功能蛋白的核苷酸序列。在另一优选例中，所述的npgA基因具有SEQIDNO:4所示的核苷酸序列，或其简并序列，或与SEQIDNO:4序列有70％以上(较佳地80％以上；更佳地90％以上；更佳的93％以上；更佳地95％以上；更佳的97％以上，如98％～99％)相同性的编码同功能蛋白的核苷酸序列。在另一优选例中，所述的lovA基因具有SEQIDNO:5所示的核苷酸序列，或其简并序列，或与SEQIDNO:5序列有70％以上(较佳地80％以上；更佳地90％以上；更佳的93％以上；更佳地95％以上；更佳的97％以上，如98％～99％)相同性的编码同功能蛋白的核苷酸序列。在另一优选例中，所述的cpr基因具有SEQIDNO:6所示的核苷酸序列，或其简并序列，或与SEQIDNO:6序列有70％以上(较佳地80％以上；更佳地90％以上；更佳的93％以上；更佳地95％以上；更佳的97％以上，如98％～99％)相同性的编码同功能蛋白的核苷酸序列。在另一优选例中，所述的uta基因具有SEQIDNO:7所示的核苷酸序列，或其简并序列，或与SEQIDNO:6序列有70％以上(较佳地80％以上；更佳地90％以上；更佳的93％以上；更佳地95％以上；更佳的97％以上，如98％～99％)相同性的编码同功能蛋白的核苷酸序列。在另一优选例中，所述的乙醇脱氢酶ADH的编码基因具有SEQIDNO:20所示的核苷酸序列，或其简并序列，或与SEQIDNO:20序列有70％以上(较佳地80％以上；更佳地90％以上；更佳的93％以上；更佳地95％以上；更佳的97％以上，如98％～99％)相同性的编码同功能蛋白的核苷酸序列。在另一优选例中，所述的乙酰辅酶A合成酶ACS的编码基因具有SEQIDNO:21所示的核苷酸序列，或其简并序列，或与SEQIDNO:21序列有70％以上(较佳地80％以上；更佳地90％以上；更佳的93％以上；更佳地95％以上；更佳的97％以上，如98％～99％)相同性的编码同功能蛋白的核苷酸序列。在另一优选例中，所述的乙酰辅酶A脱羧酶ACC的编码基因具有SEQIDNO:22所示的核苷酸序列，或其简并序列，或与SEQIDNO:22序列有70％以上(较佳地80％以上；更佳地90％以上；更佳的93％以上；更佳地95％以上；更佳的97％以上，如98％～99％)相同性的编码同功能蛋白的核苷酸序列。在另一优选例中，启动子PAOX1R的基因序列本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种二氢莫纳可林L的异源生产方法，包括：(1)提供酵母工程菌，使其表达外源的下组基因的表达盒：lovB，lovC，lovG，npgA，并以乙醇诱导型启动子驱动表达转录激活因子uta；(2)以乙醇作为碳源、前体和/或诱导剂，培养(1)的酵母工程菌，从而生成产物二氢莫纳可林L。

【技术特征摘要】
1.一种二氢莫纳可林L的异源生产方法，包括：(1)提供酵母工程菌，使其表达外源的下组基因的表达盒：lovB，lovC，lovG，npgA，并以乙醇诱导型启动子驱动表达转录激活因子uta；(2)以乙醇作为碳源、前体和/或诱导剂，培养(1)的酵母工程菌，从而生成产物二氢莫纳可林L。2.一种莫纳可林J的异源生产方法，包括：(a)提供酵母工程菌，使其表达外源的下组基因的表达盒：lovB，lovC，lovG，npgA，并以乙醇诱导型启动子驱动表达转录激活因子uta；(b)提供酵母工程菌，使其表达外源的下组基因的表达盒：lovA，cpr，并以乙醇诱导型启动子驱动表达转录激活因子uta；(c)以乙醇作为碳源、前体和/或诱导剂，培养(a)和(b)的酵母工程菌的混合菌，从而生成产物莫纳可林J。3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，(1)或(a)中，所述的酵母工程菌还表达外源的乙醇脱氢酶ADH、乙酰辅酶A合成酶ACS和乙酰辅酶A脱羧酶ACC。4.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，(1)或(a)中，以PAOX1R作为驱动lovB，lovC，lovG，npgA表达的启动子；或(b)中，以PAOX1R作为驱动lovA，cpr表达的启动子；或(1)或(a)或(b)中，以PICL1为乙醇诱导型启动子。5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，(c)中，(a)和(b)的酵母工程菌的混合菌中，(a)菌:(b)菌的比例为1...

【专利技术属性】
技术研发人员：蔡孟浩，刘一奇，张元兴，
申请(专利权)人：华东理工大学，
类型：发明
国别省市：上海,31