一种多糖蛋白结合疫苗及其鉴别方法技术

本发明专利技术涉及一种多糖蛋白结合物及其鉴别方法，以及根据上述多糖蛋白结合物制备的多糖蛋白结合疫苗及其鉴别方法。本发明专利技术的速率散射比浊法是一种基于免疫化学方法建立的技术手段，速率散射比浊法可测量悬浮于小杯中抗原抗体复合物聚集体颗粒所造成的散射光强度变化，并在几十秒内得出反应速率值。抗原抗体反应形成复合物聚集体颗粒，因抗原和/或抗体浓度的不同而速率不同。该法特异性强，灵敏度高，节约检测时间，且抗原抗体直接接触，有利于低浓度样品检测，可用于疫苗生产过程中原液和/或半成品和/或成品的鉴别。

A Polysaccharide-Protein Binding Vaccine and Its Identification Method

The present invention relates to a polysaccharide-protein conjugate and its identification method, and a polyglycoprotein-binding vaccine prepared according to the polysaccharide-protein conjugate and its identification method. The rate scattering turbidimetry of the invention is a technical means based on the immunochemical method. The rate scattering turbidimetry can measure the change of scattering light intensity caused by the aggregate particles of antigen-antibody complex suspended in a small cup and obtain the reaction rate value in tens of seconds. Antigen-antibody reactions form complex aggregates at different rates depending on the concentration of antigen and/or antibody. The method has strong specificity, high sensitivity, saving detection time and direct contact with antigens and antibodies, which is conducive to the detection of low concentration samples. It can be used for the identification of raw liquid and/or semi-finished products and/or finished products in the production of vaccines.

【技术实现步骤摘要】
一种多糖蛋白结合疫苗及其鉴别方法
本专利技术涉及医疗领域，具体的涉及疫苗及疫苗的鉴别，尤其是一种免疫原性多糖蛋白结合物及其鉴别方法以及一种多糖蛋白结合疫苗及其鉴别方法。具体的涉及一种多糖蛋白结合疫苗及其鉴别方法。
技术介绍
疫苗接种是预防感染的有效措施，疫苗质量控制尤为重要。鉴别试验是利用药物的分子结构所表现的特殊化学行为(如进行化学反应、测定药物的理化常数等)或光谱、色谱、生物学等特征，来判断药品的真伪。药物的鉴别在药物质量检验工作中属首项工作。只有药物被鉴别无误、证实被分析药物组分正确后，才有必要进行检查和含量测定等分析工作。在结合疫苗中，多糖与蛋白载体共价偶联形成结合疫苗，可使多糖由T细胞非依赖型抗原转化成T细胞依赖性抗原，增强多糖的免疫原性，产生足够的保护力。多糖和蛋白载体的鉴别是保证多糖蛋白结合疫苗真伪和质量的一项重要质控指标。由于在多糖蛋白结合疫苗中一般存在多种多糖和蛋白载体成分，鉴别试验在检测多糖蛋白结合疫苗的质量稳定性，疫苗多糖组分和蛋白组分的正确性过程中起到了至关重要的作用。除此之外，利用特异性免疫反应对多糖蛋白结合疫苗进行鉴别试验，还可以间接证明疫苗中各有效成分是否具有相应的抗原性，疫苗制备的工艺过程是否破坏了各成分的抗原性。欧洲药典《EuropeanPharmacopoeia8.0》、WHO规程《WHOTechnicalReportSeries》、《中华人民共和国药典》(2015年版三部)均要求对多糖蛋白结合疫苗原液和成品进行鉴别，如：A群脑膜炎球菌多糖结合疫苗、C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗、A群C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗、b型流感嗜血杆菌结合疫苗、肺炎球菌多糖结合疫苗。《EuropeanPharmacopoeia8.0》中C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗、b型流感嗜血杆菌结合疫苗、肺炎球菌多糖结合疫苗生产过程中原液及成品中多糖的鉴别方法为免疫学方法和核磁共振法，生产过程中原液及成品中载体蛋白的鉴别方法为免疫学方法；《WHOTechnicalReportSeries》中A群脑膜炎球菌多糖结合疫苗、b型流感嗜血杆菌结合疫苗、肺炎球菌多糖结合疫苗中推荐使用免疫学方法和核磁共振波谱；《中华人民共和国药典》(2015年版三部)中收载的A群C群脑膜炎球菌结合疫苗、b型流感嗜血杆菌结合疫苗生产过程中原液及成品的鉴别方法为免疫学方法。其中《中华人民共和国药典》(2015年版三部)中常用的免疫学方法为免疫双扩散法，该法是在琼脂板上打孔，将抗原抗体加入相应孔中，待其自由扩散后，抗原抗体形成可见的沉淀线。其中抗原抗体自由扩散的速度受分子量影响，分子量小者，扩散快，反之较慢。自由扩散这一性质使得该法耗时长，且对于分子量较大的多糖蛋白结合物而言免疫凝胶双扩散法较难形成明显的沉淀线，导致结合疫苗鉴别困难。《中华人民共和国药典》(2015年版3部)中收载的多糖蛋白结合疫苗，其结合物原液及成品均采用免疫学鉴别方法(凝胶免疫双扩散法)，该法具体操作是：取琼脂糖加生理盐水煮沸溶胀成1.5％溶液，趁热倾倒于水平玻板上(每平方厘米加0.19ml琼脂糖)，凝固后，在玻板上打方阵型孔(直径3mm，孔距3mm)。根据需要确定方阵型图数量。中央孔加入抗血清，周边孔加入供试品溶液，并留1孔加入相应阳性对照血清，每孔加样20μl，然后置水平湿盒中，37℃水平扩散24h。用生理氯化钠溶液充分浸泡琼脂糖凝胶板，将浸泡好的琼脂糖凝胶板放入0.5％氨基黑溶液中染色，浸泡30min，染色30min，用脱色液脱至背景无色，沉淀线呈清晰蓝色为止。用适当方法保存或复制图谱。该法中抗原抗体浓度不宜过小，自由扩散过程的稀释，导致浓度太小无法产生沉淀线，样品分子量过大也不利于扩散，影响试验效果。另外，整个过程耗时2天左右甚至更长，且采用自由扩散的方式使抗原抗体接触，样品分子量不宜过大，浓度不宜过低，否则均较难形成清晰的沉淀线，尤其对于在制备过程中因一系列反应使抗原性降低的样品，更难以达到免疫双扩散法中需求的适宜的抗原浓度，从而导致鉴别试验实施困难。
技术实现思路
为了克服现有疫苗鉴别技术的不足之处，本专利技术目的在于提供一种免疫原性多糖蛋白结合物及其鉴别方法，以及根据上述免疫原性多糖蛋白结合物制备的多糖蛋白结合疫苗及其鉴别方法。本专利技术的速率散射比浊法是一种基于免疫化学方法建立的技术手段，速率散射比浊法可测量悬浮于小杯中的颗粒所造成的散射光强度变化，可在几十秒内得出反应速率值。抗原抗体反应形成抗原抗体复合物聚集体颗粒，抗原或抗体浓度的不同形成颗粒的速率不同。该法特异性强，灵敏度高，节约检测时间，且抗原抗体直接接触，有利于低浓度样品检测，可用于疫苗生产过程中原液和/或半成品和/或成品的鉴别。本专利技术提供了一种免疫原性多糖蛋白结合物，包括多糖和载体蛋白，所述多糖蛋白结合物是经过免疫速率比浊进行鉴别的，和/或，所述多糖蛋白结合物中多糖是经过免疫速率散射比浊进行鉴别的，和/或，所述多糖蛋白结合物中载体蛋白是经过免疫速率散射比浊进行鉴别的。换言之，利用抗原与抗体特异结合形成抗原抗体复合物所测得的速率单位值对多糖和/或载体蛋白进行鉴别，经上述方法鉴别的多糖和/或载体蛋白组成了本专利技术的免疫原性多糖蛋白结合物。优选的是，所述免疫速率散射比浊至少包括将多糖蛋白结合物溶液与相应抗体接触形成抗原抗体复合物，再经免疫速率散射比浊测定生成抗原抗体复合物的反应速率值。上述任一方案优选的是，所述多糖蛋白结合物包括肺炎球菌荚膜多糖蛋白结合物、脑膜炎球菌荚膜多糖蛋白结合物、流感嗜血杆菌荚膜多糖蛋白结合物、伤寒沙门菌多糖蛋白结合物、金黄色葡萄球菌荚膜多糖蛋白结合物、隐球菌荚膜多糖蛋白结合物、链球菌荚膜多糖蛋白结合物、艰难梭菌荚膜多糖蛋白结合物、霍乱弧菌荚膜多糖蛋白结合物、肺炎克雷伯杆菌荚膜多糖蛋白结合物中的至少一种。上述任一方案优选的是，所述多糖蛋白结合物中多糖包括肺炎球菌任一血清型荚膜多糖、脑膜炎奈瑟球菌任一血清群荚膜多糖、流感嗜血杆菌任一血清型荚膜多糖、伤寒沙门菌Vi多糖、金黄色葡萄球菌任一血清型荚膜多糖、隐球菌任一血清型荚膜多糖、链球菌任一血清群荚膜多糖、艰难梭菌任一血清群荚膜多糖、霍乱弧菌任一血清群荚膜多糖、肺炎克雷伯杆菌任一血清型荚膜多糖中的至少一种。上述任一方案优选的是，所述多糖蛋白结合物中载体蛋白包括破伤风类毒素(TT)、白喉类毒素(DT)、白喉毒素无毒变异体(CRM197)、B群脑膜炎球菌外膜蛋白(OMP)、肺炎球菌表面蛋白A(PspA)、肺炎球菌溶血素(Ply)、流感嗜血杆菌D蛋白(PD)、百日咳毒素(PT)、百日咳丝状凝血素(FHA)、百日咳黏附素(PRN)、霍乱毒素(CT)、胞壁酰二肽(MDP)、大肠杆菌不耐热肠毒素(LT)、大肠杆菌耐热肠毒素(ST)、结核菌素纯蛋白衍生物(PPD)、铜绿假单胞菌外毒素A(PEA)、卵白蛋白、匙孔血蓝蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)、乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)、乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)、破伤风毒素C片段(TTC)中的至少一种。本专利技术还公开一种鉴别免疫原性多糖蛋白结合物中多糖的免疫速率散射比浊方法，包括下列步骤：(1)检测多糖抗原标准品与抗体反应速率值；(2)改变反应时间检测抗原抗体反应速率值；(3)标定抗原抗体反应浓本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种免疫原性多糖蛋白结合物，包括多糖和载体蛋白，其特征在于，所述多糖蛋白结合物是经过免疫速率比浊进行鉴别的，和/或，所述多糖蛋白结合物中多糖是经过免疫速率散射比浊进行鉴别的，和/或，所述多糖蛋白结合物中载体蛋白是经过免疫速率散射比浊进行鉴别的。

【技术特征摘要】
1.一种免疫原性多糖蛋白结合物，包括多糖和载体蛋白，其特征在于，所述多糖蛋白结合物是经过免疫速率比浊进行鉴别的，和/或，所述多糖蛋白结合物中多糖是经过免疫速率散射比浊进行鉴别的，和/或，所述多糖蛋白结合物中载体蛋白是经过免疫速率散射比浊进行鉴别的。2.根据权利要求1所述的免疫原性多糖蛋白结合物，其特征在于，所述免疫速率散射比浊至少包括将多糖蛋白结合物溶液与相应抗体接触形成抗原抗体复合物，再经免疫速率散射比浊测定生成抗原抗体复合物的反应速率值。3.根据权利要求1或2所述的免疫原性多糖蛋白结合物，其特征在于，所述多糖蛋白结合物包括肺炎球菌荚膜多糖蛋白结合物、脑膜炎球菌荚膜多糖蛋白结合物、流感嗜血杆菌荚膜多糖蛋白结合物、伤寒沙门菌多糖蛋白结合物、金黄色葡萄球菌荚膜多糖蛋白结合物、隐球菌荚膜多糖蛋白结合物、链球菌荚膜多糖蛋白结合物、艰难梭菌荚膜多糖蛋白结合物、霍乱弧菌荚膜多糖蛋白结合物、肺炎克雷伯杆菌荚膜多糖蛋白结合物中的至少一种。4.根据权利要求1或2所述的免疫原性多糖蛋白结合物，其特征在于，所述多糖蛋白结合物中多糖包括肺炎球菌任一血清型荚膜多糖、脑膜炎奈瑟球菌任一血清群荚膜多糖、流感嗜血杆菌任一血清型荚膜多糖、伤寒沙门菌Vi多糖、金黄色葡萄球菌任一血清型荚膜多糖、隐球菌任一血清型荚膜多糖、链球菌任一血清群荚膜多糖、艰难梭菌任一血清群荚膜多糖、霍乱弧菌任一血清群荚膜多糖、肺炎克雷伯杆菌任一血清型荚膜多糖中的至少一种。5.根据权利要求1或2所述的免疫原性多糖蛋白结合物，其特征在于，所述多糖蛋白结合物中载体蛋白包括破伤风类毒素(TT)、白喉类毒素（DT）、白喉毒素无毒变异体（CRM197）、B群脑膜炎球菌外膜蛋白（OMP）、肺炎球菌表面蛋白A（PspA）、肺炎球菌溶血素（Ply）、流感嗜血杆菌D蛋白（PD）、百日咳毒素（PT）、百日咳丝状凝血素（FHA）、百日咳黏附素（PRN）、霍乱毒素（CT）、胞壁酰二肽（MDP...

【专利技术属性】
技术研发人员：王倩，罗丽娜，张建军，苏玉婷，钟正丹，王超，李银波，敬小兵，刘思利，凌燕，杨冬妮，黄放，王岩，薛平，
申请(专利权)人：成都安特金生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：四川,51