基于微流控芯片检测总甲状腺素TT4试剂盒及制备和检测方法技术

本发明专利技术公开了一种基于微流控芯片的总甲状腺素TT4试剂盒及制备和检测方法，该试剂盒的制备方法，包括以下步骤：(1)微流控芯片包被；(2)荧光微球标记；(3)微流控芯片组装；(4)定标品的制备；(5)得基于微流控芯片的总甲状腺素TT4试剂盒。制备得到的总甲状腺素TT4试剂盒采用竞争法进行测定，选取高灵敏度的时间分辨荧光物作为标记物，在荧光微球上进行抗原的标记，利用免疫竞争反应进行分析检测，所制备的试剂性能可达同等化学发光试剂的水平。免疫反应后，使用清洗液将多余组分完全去除后，对免疫反应结合上的荧光微球进行检测读数，避免了引入显色液进入芯片内部反应不充分或者显色后读数不及时的问题。

【技术实现步骤摘要】
基于微流控芯片检测总甲状腺素TT4试剂盒及制备和检测方法
本专利技术属于免疫检测领域，尤其是涉及一种基于微流控芯片检测总甲状腺素TT4试剂盒及制备和检测方法。
技术介绍
微流控芯片技术是以微管道网络为结构特征，采用微加工技术在几平方厘米大小的芯片上刻蚀出微管道网络和其它功能单元，从而制备出包含进样、反应、分离、检测于一体的快速、高效、低耗的微型分析装置。微流控芯片在检测平台中具有试剂消耗少，反应时间短，自动化程度高的特点。在目前的研究中，芯片的微型化却给前期样品分离和配套集成带来不少困难，同时在样品固定，洗脱等方面也存在不少问题。微流控芯片检测主要有以下几点优势：1)器件微小且没有对人为操作，试剂消耗量很少；2)通过设计不同微流路实现在同一芯片中不同试剂的混合反应，减少繁琐的生物实验操作缩短检测所需时间；3)微流控芯片可与电路接合实现自动化控制；4)微流控芯片以及配套检测设备体积小巧，易于便携。总甲状腺素(TT4)是一种由甲状腺合成并分泌的激素，也是构成甲状腺、脑垂体和下丘脑参与的负反馈机制的完整性不可缺少的成分。对合成代谢有影响作用，T4有两分子的二碘酪氨酸(DIT)在甲状腺内偶联生成。T4与甲状腺球蛋白结合储存在甲状腺滤泡的残腔中，在促甲状腺激素TSH的调节下分泌释放。在血清中99％以上的T4以与其他蛋白质结合的形式存在，由于血清中运输蛋白的浓度易受到外源性和内源性作用的影响。因此，在检测血清T4浓度的过程中需要考虑到结合蛋白质的状况，如果忽略这一点，结合蛋白质的浓度的变化(如怀孕期，服用雌激素或者患肾病综合征等)，会导致反应甲状腺代谢状况检测的错误结果。甲状腺功能失调可引起T3和T4分泌的过量(甲状腺功能亢进)或不足(甲状腺功能减退)。此外，由于甲状腺功能直接受TSH(促甲状腺激素)的影响，如果脑垂体或下丘脑功能失调的话，也会影响甲状腺的功能。因此只要甲状腺-脑垂体-下丘脑系统中任何一部分发生疾病，血液中的T3、T4水平都会受到影响。T4浓度是甲状腺功能减退的敏感指标，T4检测可用于甲亢，原发性和继发性甲状腺功能减退的诊断以及TSH抑制治疗的检测。在中国专利文献CN104614521A中公开了一种微流控芯片，包括柔性聚合物层和基片，柔性聚合物层和基片键合在一起，所述芯片中设有微沟道系统，所述微沟道系统包括缓冲液入口、样品入口、磁珠入口、废液出口、微阀、微泵区、磁珠塞区、循环区及检测区。上述技术方案采用灵敏度较低的比浊法，检测免疫磁珠和待测物之间的免疫反应所形成的络合物进行反应物前后的浊度变化，来进行判定待测物的浓度。相对而言，在采用免疫比浊这一方法学来说，由于不需要额外的配对抗体以及发光标记物，因此整体芯片结构设计较为简单。通过磁场在芯片沟道中形成的特定区域富集磁珠，样品持续通过此部分磁珠塞后与另一测磁珠结合，从而形成两个以上的磁珠团聚。采用其他现有技术或(1)芯片的结构过于复杂，无法对反应做出精确的调控，清洗步骤以及液体传导存在较大的污染；或(2)使用了多个液体腔室和固相载体(磁珠以及荧光微球同时使用)，试剂整体设计过于复杂；或(3)免疫反应采用了非均相反应，意为固相载体与固相载体的表面进行反应，反应不充分，灵敏度和重复性受到限制。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种选取高灵敏度的时间分辨荧光物作为标记物，在荧光微球上进行抗原的标记，利用免疫竞争反应进行分析检测，所制备的试剂性能可达同等化学发光试剂的水平，免疫反应效率更高更充分的基于微流控芯片检测总甲状腺素TT4试剂盒的制备方法。为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案是，该基于微流控芯片检测总甲状腺素TT4试剂盒的制备方法，包括以下步骤：(1)微流控芯片包被：取甲状腺素T4抗体PAB<T4>SIgG1mg，加50mMpH9.6的CB缓冲液至1mL，按照单个芯片25uL加入微流控芯片反应腔室内，温浴2小时后对芯片进行清洗；(2)荧光微球标记：取总甲状腺素TT4抗原Thyroxine加入至荧光微球溶液中，并涡旋混匀，其中，荧光微球是经过活化处理的，反应结束后，加入终止液对反应进行终止，后离心清洗，加入封闭液进行封闭，封闭后的荧光微球进行离心清洗，使用微球储存液进行保存；(3)微流控芯片组装：向微流控芯片的反应腔室预先进行封闭处理，封闭液添加后在烘箱中进行烘干处理，在封闭后的中层芯片背部反应腔室下部内加入所述步骤(2)中的荧光微球溶液，于真空烘箱中真空干燥，荧光微球在芯片中呈现小液滴形态，不发生扩散；芯片准备完毕后采用超声键合的方式，依据芯片结构依次将滤血垫，加样密封垫，导电橡胶，吸水纸以及密封圈加入芯片内部，将三层芯片按照超声键合线完成合并；(4)定标品的制备：定标品由A组分和B组分构成；根据抗原浓缩液的估算浓度，用定标品稀释液将抗原浓缩液稀释作为定标品抗原母液备用；定标品稀释液即为定标品A组分，浓度为0.5ng/mL，2-8℃保存；定标品B组分：用定标品稀释液将总甲状腺素TT4抗原母液稀释至2ng/mL，2-8℃保存；(5)得基于微流控芯片的总甲状腺素TT4试剂盒。在本专利技术中，定标品稀释液主要为Tris-HCl的缓冲体系，浓度为50mM，pH8.5，包含牛血清、BSA、表面活性剂RPE1740、RPE2520以及叠氮钠；在所述步骤(3)中，稀释标记总甲状腺素TT4抗原Thyroxine微球，预先将微球水浴超声混匀，取20微升微球+80微升抽干保存液，混匀水浴超声，在封闭好的芯片下层反应槽正中间加5微升荧光微球溶液，于45℃真空烘箱中真空干燥30min，将处理好的芯片组装起来，超声键合，最后铝箔袋保存并加入干燥剂。在上述技术方案中，试剂基于微流控芯片作为载体，在微流控芯片内部的微流道反应器中进行免疫检测反应，单个芯片供单人份测试使用；制备得到的试剂盒进行检测，在手动加样后，仪器实现待测物在微流控芯片内的液体流动控制，免疫反应的调控以及反应结束后的清洗步骤，仪器通过收集荧光信号并计算出具体的反应值；该试剂可用于辅助诊断甲亢，原发性和继发性甲状腺功能减退的患者诊断以及TSH抑制治疗；本专利技术技术方案制备得到的总甲状腺素TT4试剂盒采用竞争法进行测定，患者血样中的T4与一种T4类似物竞争数量有限的、包被于芯片内部的T4抗体，上述T4类似物预先标记在荧光微球上，并进行干燥处理。血样进入芯片内部后，溶解抽干后的微球，血样中T4组分与标记有荧光微球的T4类似物共同参与免疫反应，待反应结束清洗除去多余未结合的T4和荧光微球，通过对芯片在360nm波长下激发，检测捕获的荧光微球在615nm下的荧光，测定其产生的荧光信号，以相对发光单位(RLU)进行表示。样本中的T4浓度与仪器测定的RLU成反比关系，通过自动计算获得浓度值。此外，上述制备方法中采用的微流控芯片为在中国专利文献CN107219360A中公布的技术方案，申请人在此予以引入；选取高灵敏度的时间分辨荧光物作为标记物，在荧光微球上进行T4类似物的标记，利用抗体捕获血样中T4以及荧光微球上T4类似物进行免疫竞争反应进行分析检测，所制备的试剂性能可达同等化学发光试剂的水平。反应采用均相反应，在微流控芯片腔室内通过超声混合，避免了单线程的层析流动反应，使得反应效率更高本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于微流控芯片的总甲状腺素TT4试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)微流控芯片包被：取甲状腺素T4抗体PAB

【技术特征摘要】
1.一种基于微流控芯片的总甲状腺素TT4试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)微流控芯片包被：取甲状腺素T4抗体PAB<T4>SIgG1mg，加50mMpH9.6的CB缓冲液至1mL，按照单个芯片25uL加入微流控芯片反应腔室内，温浴2小时后对芯片进行清洗；(2)荧光微球标记：取总甲状腺素TT4抗原Thyroxine加入至荧光微球溶液中，并涡旋混匀，其中，荧光微球是经过活化处理的，反应结束后，加入终止液对反应进行终止，后离心清洗，加入封闭液进行封闭，封闭后的荧光微球进行离心清洗，使用微球储存液进行保存；(3)微流控芯片组装：向微流控芯片的反应腔室预先进行封闭处理，封闭液添加后在烘箱中进行烘干处理，在封闭后的中层芯片背部反应腔室下部内加入所述步骤(2)中的荧光微球溶液，于真空烘箱中真空干燥，荧光微球在芯片中呈现小液滴形态，不发生扩散；芯片准备完毕后采用超声键合的方式，依据芯片结构依次将滤血垫，加样密封垫，导电橡胶，吸水纸以及密封圈加入芯片内部，将三层芯片按照超声键合线完成合并；(4)定标品的制备：定标品由A组分和B组分构成；根据抗原浓缩液的估算浓度，用定标品稀释液将抗原浓缩液稀释作为定标品抗原母液备用；定标品稀释液即为定标品A组分，浓度为0.5ng/mL，2-8℃保存；定标品B组分：用定标品稀释液将总甲状腺素TT4抗原母液稀释至2ng/mL，2-8℃保存；(5)得基于微流控芯片的总甲状腺素TT4试剂盒。2.根据权利要求1所述的基于微流控芯片的总甲状腺素TT4试剂盒的制备方法，其特征在于，在所述步骤(2)中，所述荧光微球活化处理的方法为：称取EDC使用Mes缓冲液配置成为10mg/mL的溶液，后使用Mes缓冲液进一步稀释成为1mg/mL的溶液，量取1mg羧基荧光微球，微球固型物含量为10mg/mL，体积计算为100μL，置于EP管中，加入0.45mLMes缓冲液稀释，从1mg/mL的EDC活化剂溶液中取5uL迅速加入微球溶液中，涡旋混匀，于超声清洗器中超声10min，后置于滚轴混匀器上震荡反应20min，总反应时间为30min。3.根据权利要求1所述的基于微流控芯片的总甲状腺素TT4试剂盒的制备方法，其特征在于，在所述步骤(3)中，所述封闭液含有2％BSA、0.5％Tween-20、10％海藻糖以及0.2％甘露醇。4.根据权利要求3所述的基于微流控芯片的总甲状腺素TT4试剂盒的制备方法，其特征在于，在所述步骤(3)中，封闭处理的方法为：向微流控芯片的反应腔室预先进行封闭处理，其中第二层芯片的背面反应腔室内需要添加6μL+6μL的封闭液进行封闭，第三层正面的反应腔室内，分别需要添加5μL+5μL+5μL的封闭液进行封闭。5.根据权利要求1所述的基于微流控芯片的...

【专利技术属性】
技术研发人员：许行尚，杰弗瑞·陈，朱宗哲，
申请(专利权)人：南京岚煜生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32