伏立诺他在氧化响应阳离子聚合物基因载体介导的基因治疗中的应用制造技术

本发明专利技术首次发现伏立诺他在氧化响应阳离子聚合物基因载体介导的基因治疗中的新用途，并联合TRAIL基因，显著提高了肿瘤细胞的治疗效果。经实验发现，伏立诺他能够在不产生细胞毒性的浓度下引起细胞内ROS的上调，可以促进ROS响应阳离子聚合物的电荷反转，进而促进DNA的释放，增强最终的基因转染效果。

Application of Vorino in Gene Therapy Mediated by Cationic Polymer Gene Vector in Oxidation Response

The present invention discovers for the first time a new application of vorinol in gene therapy mediated by oxidative response cationic polymer gene vector, and combines TRAIL gene to significantly improve the therapeutic effect of cancer cells. It was found that vorinol could induce the up-regulation of ROS in cells without cytotoxicity. It could promote ROS to respond to the charge reversal of cationic polymers, thereby promoting the release of DNA and enhancing the final effect of gene transfection.

【技术实现步骤摘要】
伏立诺他在氧化响应阳离子聚合物基因载体介导的基因治疗中的应用
本专利技术涉及生物医学领域，尤其涉及伏立诺他在氧化响应阳离子聚合物基因载体介导的基因治疗中的应用。
技术介绍
基因输送(基因治疗)被认为是一种很有潜力的疾病治疗方式，尤其是针对癌症的治疗。成功的基因输送很大程度上依赖于安全高效的输送载体的研究和发展。病毒载体因为其具有极高的转染效率曾受到广泛关注和研究，但其可能存在的安全问题，包括免疫原性，生物相容性等，限制了病毒载体的进一步发展。这也使得基于非病毒载体的基因输送成为了一种可选择的基因治疗手段。但是，非病毒载体基因输送的关键问题是转染效率低，无法达到临床应用的需求。主要原因是非病毒载体系统应对细胞外和细胞内复杂环境的能力太弱。在非病毒载体介导的基因输送中，阳离子聚合物是十分常用的一种载体，他通过其正电性压缩带负电的DNA分子形成稳定的纳米复合物。但纳米复合物进入细胞后，因为载体与DNA分子之间较强的结合作用，DNA的释放可能会受到干扰和抑制，最终无法实现高效的蛋白表达。为了克服这个阻碍促进DNA的释放过程，研究者们开发了许多种能够响应细胞内刺激因子释放DNA的聚合物来实现高效的基因输送和肿瘤治疗。有文献报道：通常情况下，肿瘤细胞内的活性氧自由基(ROS)的水平高于正常细胞，因此可以作为一种刺激因子调控基因输送过程。申请公布号为CN105153339A的专利技术专利申请文献公开了一种能够响应细胞内ROS发生电荷反转的阳离子聚合物载体B-PDEAEA，是通过4-溴甲基苯硼酸与N,N-二乙氨基丙烯酸乙酯季胺化合成的；它能够在ROS的刺激下在细胞质中快速释放DNA，实现较高水平的基因转染。但是，不同细胞内的ROS水平存在差异，当细胞内的ROS水平较低时，则无法有效引起载体的电荷反转过程，载体与DNA不能高效解离，仍然会影响最终的蛋白表达。伏立诺他(简写SAHA)是FDA批准上市的第一个组蛋白去乙酰化酶抑制剂产品，用于皮肤T细胞淋巴瘤的治疗。它在具有一定抗肿瘤活性的同时，毒副作用较小。目前有超过50种联合伏立诺他的治疗方法正处于临床实验当中，主要针对多种肿瘤的治疗。TRAIL是肿瘤坏死因子超家族成员之一。它能够特异性地对肿瘤细胞产生毒性但不损伤正常细胞，是一种很有潜力的肿瘤治疗方法。重组的TRAIL蛋白因为不稳定，在血液中的半衰期短等问题使得TRAIL基因输送成为了一种替代的治疗方案。在肿瘤部位实现高效的TRAIL蛋白表达能够很大程度上增强肿瘤的治疗效果。本专利技术首次发现伏立诺他在不产生细胞毒性的浓度下能够引起细胞内ROS的上调，可以促进ROS响应阳离子聚合物的电荷反转，进而促进DNA的释放，增强最终的基因转染效果。该发现在本
中未见报道。
技术实现思路
本专利技术发现了伏立诺他在氧化响应阳离子聚合物基因载体介导的基因治疗中的新用途。原理在于：伏立诺他能够在不产生细胞毒性的浓度下引起细胞内ROS的上调，可以促进ROS响应阳离子聚合物的电荷反转，进而促进DNA的释放，增强最终的基因转染效果。本专利技术还提供了伏立诺他在氧化响应阳离子聚合物基因载体介导的肿瘤细胞治疗中的应用。本专利技术中，所述氧化响应阳离子聚合物基因载体，可采用包括如下片段的高分子聚合物：上式中：R1、R2为分别独立的为C1-C6的烷基或芳香基；R3、R4为分别独立的为H、C1-C6的烷基酰基；m为1-4的正整数；阴离子为溴离子或氯离子。所述R3、R4为H、乙酰基或甲酰基，R1、R2为甲基、乙基。上述阳离子聚合物(具体制备方法见申请号201510656807.5的专利技术专利)带有大量正电荷，能够与带负电的DNA等核酸药物通过静电自组装形成稳定的纳米复合物；进入细胞后，硼酸或硼酯被ROS氧化时，发生去酚基苄醇反应，季铵盐会变为三级胺，随后可通过自催化酯键水解生成带负电的聚合物，从而与带负电的核酸药物相互排斥而快速解离，释放出核酸药物进行有效转染。申请号201510656807.5的专利技术专利公开的氧化响应阳离子聚合物均可作为本专利技术所述的氧化响应阳离子聚合物基因载体，在伏立诺他引起细胞内ROS上调后，通过水解生成带负电的聚合物，并与核酸药物解离。作为优选，所述氧化响应阳离子聚合物基因载体为下列结构式的化合物：上式中n为重复单元的个数，n为5-500。本专利技术通过实验进一步验证了伏立诺他在氧化响应阳离子聚合物基因载体介导的肿瘤细胞治疗中的应用。作为优选，所述氧化响应阳离子聚合物基因载体携带的基因为TRAIL基因。作为优选，所述细胞为A549细胞或HeLa细胞。本专利技术以A549细胞和HeLa细胞作为基因治疗的目标细胞，B-PDEAEA为基因载体，联合TRAIL基因作为治疗基因，在加入聚合物载体-外源基因复合物的同时加入伏立诺他进行共同孵育，并采用EGFP(增强型绿色荧光蛋白)或Luciferase(荧光素酶)两种典型标记作为标记蛋白，发现：伏立诺他能够在不产生细胞毒性的浓度下引起细胞内ROS的上调，可以促进ROS响应阳离子聚合物的电荷反转，进而促进DNA的释放，增强了TRAIL基因的治疗效果。进一步地，以培养基为基准，所述伏立诺他的浓度为1～10μM。伏立诺他浓度过高时会产生细胞毒性，故采用低浓度的伏立诺他。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：本专利技术首次发现伏立诺他在氧化响应阳离子聚合物基因载体介导的基因治疗中的新用途，并联合TRAIL基因，显著提高了肿瘤细胞的治疗效果。经实验发现，伏立诺他能够在不产生细胞毒性的浓度下引起细胞内ROS的上调，可以促进ROS响应阳离子聚合物的电荷反转，进而促进DNA的释放，增强最终的基因转染效果。附图说明图1为氧化响应阳离子聚合物基因载体B-PDEAEA的电荷反转过程。图2为伏立诺他的作用机理示意图。图3为实施例2中不同浓度的伏立诺他引起A549细胞和HeLa细胞内ROS上调的效果图。图4为实施例3中A549细胞和HeLa细胞在不同浓度伏立诺他的处理条件下的存活率。图5为实施例4中A549细胞和HeLa细胞经2μM伏立诺他处理后的Luciferase基因转染结果。图6为实施例5中A549细胞经2μM伏立诺他处理后的EGFP基因转染结果。图7为实施例6中经2μM伏立诺他处理后A549细胞内的氧化响应阳离子聚合物基因载体B-PDEAEA与DNA的解离情况；其中，A为使用激光共聚焦显微镜观察得到的载体与DNA的重合情况，B为通过图像处理软件ImageJ计算得到的载体与DNA的重合比例。图8为实施例7中经2μM伏立诺他处理后A549细胞的凋亡效果。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术作进一步描述，以下列举的仅是本专利技术的具体实施例，但本专利技术的保护范围不仅限于此。下列实施例中，HEPES缓冲液和含10％FBS(胎牛血清)的RPMI-1640参照实验手册进行配置；B-PDEAEA的结构式和制备方法均参照申请号201510656807.5的专利技术专利文献中实施例1合成方法2的内容。单体DEAEA购于安耐吉公司，4-溴甲基苯硼酸购于苏州苏凯路化学。实施例1细胞的培养和纳米复合物的制备A549细胞和HeLa细胞使用含10％FBS的RPMI-1640培养基，置于恒温培养箱中培养，培养箱温度设定在37℃，CO2浓度为5％。B-PDEAEA/DNA本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.伏立诺他在氧化响应阳离子聚合物基因载体介导的基因治疗中的应用。

【技术特征摘要】
1.伏立诺他在氧化响应阳离子聚合物基因载体介导的基因治疗中的应用。2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述伏立诺他通过引起细胞内ROS含量的上调，促进氧化响应阳离子聚合物基因载体的电荷反转，进而促进基因的释放。3.伏立诺他在氧化响应阳离子聚合物基因载体介导的肿瘤细胞治疗中的应用。4.如权利要求1或3所述的应用，其特征在于，所述氧化响应阳离子聚合物基因载体，包括如下片段：上式中：R1、R2为分别独立的为C1-C6的烷基或芳香基；R3、R4为分别独立的为H、C1-C6...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘祥瑞，周雪飞，周珠贤，唐建斌，申有青，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33