用于癌症治疗的工程化TRAIL制造技术

提供了工程化单链TRAIL分子，以及改善这些分子的稳定性和可制造性的特定突变和突变组合。提供这些分子用作抗癌治疗剂。

Engineering TRAIL for cancer treatment

Engineering single-chain TRAIL molecules and specific mutation and mutation combinations to improve their stability and manufacturability are provided. These molecules are provided as anticancer agents.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于癌症治疗的工程化TRAIL相关申请本申请要求于2016年3月16日提交的美国临时申请号62/309,352、于2016年4月15日提交的62/323,501和于2017年1月12日提交的62/445,556的优先权。上述申请的内容在此引入作为参考。序言Apo2L/TRAIL(TNF相关凋亡诱导配体，CD253)是TNF家族的成员，其结合并激活死亡受体(特别是DR4和DR5)。TRAIL还结合非信号传导诱饵受体DcR1、DcR2和护骨因子(OPG)。TRAIL作为2型跨膜蛋白天然存在，具有可被切割以释放可溶性三聚体蛋白的细胞外结构域。受体复合物的聚集例如由TRAIL的三聚体结构介导，对于有效信号传导和死亡受体诱导细胞凋亡是必需的。另外，受体复合物的更高级寡聚化可以放大信号传导，导致更多地诱导细胞凋亡。已经产生可溶性重组TRAIL并作为癌症治疗剂进行测试。它在人体中具有短的半衰期(约0.5-1小时)(Herbst等人,JournalofClinicalOncology,2010Jun10；28(17):2839-46)，这可能限制其功效。另外，TRAIL配体的表达是困难的。重组TRAIL构建体是不稳定的，并且特征在于低解链温度(Tm)和形成错误折叠聚集体的倾向，这可能导致不希望的毒性(Lawrence等人，NatureMedicine,2001Apr；7(4):383-5)。三聚体的稳定化主要已通过N末端融合至支架结构域(例如生腱蛋白-C的修饰的亮氨酸拉链或三聚化结构域)来尝试(Walczak等人，NatureMedicine,1999Feb；5(2):157-63)。这些稳定结构域可能导致增加的免疫原性，限制了它们在治疗中的效用。已经描述了通过肽接头连接的TRAIL的单链融合多肽作为产生三聚化TRAIL的替代方法(Schneider等人，CellDeath&Disease,2010Aug26；1:e68)。然而，我们观察到该分子不适合临床开发，因为它显示出在血清中温育时以聚集、低热解链温度和/或活性丧失为特征的不稳定性。先前尝试制备重组人TRAIL作为治疗剂的主要缺点之一是短的血清半衰期(表1)。表1已经显示TRAIL的单个多肽链变体(其中肽接头用于连接相邻的TRAIL单体)略微改善其血清半衰期(T1/2～35分钟)和生物活性(Schneider等人，CellDeath&Disease,2010Aug26；1:e68)。然而，改善的T1/2对于有效的临床使用来说仍然太短。因此，仍然需要一种死亡受体激动剂，其可以表达、纯化，具有足够的稳定性用于商业制造和分配，并保留体内生物活性。本公开解决了这种需要并提供了额外的优点。附图简要说明图1A：Fab-scTRAIL的图示。scTRAIL(灰色)与抗-EpCAMMOC31重链(白色)的C末端融合。MOC31的轻链表示为阴影线。还显示了Fab的恒定结构域之间的单个二硫键(直线)和连接Fab与TRAIL单体并将TRAIL单体彼此连接的甘氨酸-丝氨酸接头(曲线)。图1B：scTRAIL变体(T1-T9)以TRAIL序列长度和甘氨酸丝氨酸接头长度的矩阵表示。图按外观顺序分别公开了SEQIDNO：108-109和106。图1C：在非还原和还原条件下对T1-T9变体(2μg)进行SDS-PAGE分析。图1D-1L：使用SuperSW3000柱对T1-T9变体进行尺寸排阻色谱。指示了主峰的百分比。图2A-2C：使用HeLa细胞在细胞活力测定中Fab-scTRAIL变体的活性。用递增浓度的T1-T9处理细胞24小时。通过测量ATP水平确定细胞活力，并根据蛋白质浓度作图。图3：与人IgG1Fc(白色)的C末端融合的scTRAIL(灰色)同源二聚体的卡通表示。还显示了铰链区的二硫键和连接TRAIL单体的GS接头。图4：使用SuperSW3000对Fc-scTRAIL进行尺寸排阻色谱。在非还原和还原条件下对Fc-scTRAIL(1μg)进行SDS-PAGE分析。图5A-5D：使用COLO205(图5A)、HCT116(图5B)、DU145细胞(图5C)和Jurkat细胞(图5D)在细胞活力测定中Fc-scTRAIL的活性。用递增浓度的Fc-scTRAIL、TRAIL和激动性DR4和DR5抗体处理细胞24小时。通过测量ATP水平确定细胞活力，并根据蛋白质浓度作图。图6A-B：使用Jurkat细胞在细胞活力测定中的激动性DR4和DR5抗体和Fc-scTRAIL的活性。在图6A中，用递增浓度的抗-DR4(空心方块)、交联抗-DR4(实心方块)、抗-DR5(空心圆圈)和交联抗-DR5(实心圆圈)处理细胞24小时。在图6B中，用递增浓度的交联抗DR4、交联抗DR5、交联抗DR4和5的组合和Fc-scTRAIL处理细胞24小时。在图6B中，用递增浓度的交联抗DR4、交联抗DR5、交联抗DR4和5的组合和Fc-scTRAIL处理细胞24小时。图7A-C：使用DU145(图7A)、COLO205(图7B)和PANC1(图7C)细胞在细胞活力测定中的激动性DR4和DR5抗体和Fc-scTRAIL的活性。用递增浓度的交联抗-DR4(实心方块)、交联抗-DR5(实心三角)、交联抗DR4和5(实心圆圈)和Fc-scTRAIL(空心圆圈)处理细胞24小时。通过测量ATP水平确定细胞活力，并根据蛋白质浓度作图。图8：使用H1993细胞在细胞活力测定中的Fc-scTRAIL和Fc-scTRAILQ变体的活性。用递增浓度的Fc-scTRAIL(圆圈)、Fc-scTRAILQ1(菱形)、Fc-scTRAILQ2(方块)、Fc-scTRAILQ3(三角)处理细胞24小时。通过测量ATP水平确定细胞活力，并根据蛋白质浓度作图。图9A-9B：(图9A)TRAIL和Fc-scTRAIL的热解链曲线。(图9B)0、3和7天血清温育后Fc-scTRAIL的活性。用递增浓度的血清温育的Fc-scTRAIL处理HCT116细胞24小时，通过测量ATP水平测定细胞活力，并根据蛋白浓度作图。图10A-10C：酵母文库淘选的流式细胞分析。用生物素-DR5-Fc(10nM)和抗-FLAG(2μg/ml)接着SA/Alexa647和抗-小鼠/Alexa488标记细胞。测量荧光并在双变量图中表示。(图10A)未选择的文库。(图10B)经过4轮淘选后的富集群体。(图10C)与野生型TRAIL重叠的示例性克隆。图11：Fc-scTRAIL变体T148、T151和T153的氨基酸取代和热解链曲线。图12A-12D：血清温育的Fc-scTRAIL(图12A)和Fc-scTRAIL变体(图12B-12D)的细胞活力测定。用血清温育的T148、T151和T153处理HCT116细胞24小时。显示0、3和7天温育的样品的细胞活力曲线。图13：Fc-scTRAIL变体T183、T186和T191的氨基酸取代和热解链曲线。图14A-14D：血清温育的Fc-scTRAIL(图14A)和Fc-scTRAIL变体(图14B-14D)的细胞活力测定。用血清温育的T183(图14C)、T186(图14B)和T191(图14D)处理HCT本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种Fc‑TRAIL融合多肽的单突变体多肽链，其包含通过至少一个Fc间二硫键二聚化的两条多肽链，所述突变体链包含与一组三个人TRAIL单体部分结合以形成单个无支链多肽的人IgG Fc部分，所述单个无支链多肽在氨基末端至羧基末端顺序上包含Fc部分、TRAIL‑Fc接头、第一TRAIL单体、TRAIL单体间接头、第二TRAIL单体、第二TRAIL单体间接头和第三TRAIL单体，其中，所述每个接头由15‑20个氨基酸组成，并且所述两个TRAIL单体间接头中的每一个包含3个G4S结构域，并且其中，所述三个TRAIL单体中的至少两个包含在天然野生型人TRAIL中没有发现的至少一个稳定化突变，并且其中，通过两个拷贝的所述突变体多肽链的二聚化形成的所述Fc‑TRAIL融合多肽表现出大于或等于65℃的解链温度。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.03.16 US 62/309,352;2016.04.15 US 62/323,501;1.一种Fc-TRAIL融合多肽的单突变体多肽链，其包含通过至少一个Fc间二硫键二聚化的两条多肽链，所述突变体链包含与一组三个人TRAIL单体部分结合以形成单个无支链多肽的人IgGFc部分，所述单个无支链多肽在氨基末端至羧基末端顺序上包含Fc部分、TRAIL-Fc接头、第一TRAIL单体、TRAIL单体间接头、第二TRAIL单体、第二TRAIL单体间接头和第三TRAIL单体，其中，所述每个接头由15-20个氨基酸组成，并且所述两个TRAIL单体间接头中的每一个包含3个G4S结构域，并且其中，所述三个TRAIL单体中的至少两个包含在天然野生型人TRAIL中没有发现的至少一个稳定化突变，并且其中，通过两个拷贝的所述突变体多肽链的二聚化形成的所述Fc-TRAIL融合多肽表现出大于或等于65℃的解链温度。2.根据权利要求1所述的多肽链，其中，所述至少一个稳定化突变的位置对应于野生型TRAIL(SEQIDNO：28)的位置247，并且是位于野生型TRAIL的该位置的除异亮氨酸以外的氨基酸。3.根据权利要求2所述的多肽链，其中，所述除异亮氨酸以外的氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸或亮氨酸。4.根据权利要求2所述的多肽链，其中，所述除异亮氨酸以外的氨基酸是缬氨酸(I247V)。5.根据权利要求1所述的多肽链，其中，所述至少一个稳定化突变选自R121I、R130G、Y213W、S215D、N228S和I247V。6.根据权利要求1所述的多肽链，其中，所述至少一个稳定化突变包含选自以下六个组合的至少两个稳定化突变的组合：1)R121I和I247V；2)N228S和I247V；3)R130G和I247V；4)R121I、R130G、Y213W、S215D和I247V；5)R130G、Y213W、S215D和I247V；以及6)R130G、Y213W、S215D、N228S和I247V。7.一种TRAIL融合多肽的单突变体多肽链，所述突变体链包含与一组三个人TRAIL单体部分结合以形成单个无支链多肽的人血清白蛋白部分，所述单个无支链多肽在氨基末端至羧基末端顺序上包含Fc部分、TRAIL-Fc接头、第一TRAIL单体、TRAIL单体间接头、第二TRAIL单体、第二TRAIL单体间接头和第三TRAIL单体，其中，所述每个接头由15-20个氨基酸组成，并且所述两个TRAIL单体间接头中的每一个包含3个G4S结构域，和其中，所述三个TRAIL单体中的至少两个包含在天然野生型人TRAIL中没有发现的至少一个稳定化突变，并且其中，通过两个拷贝的所述突变体多肽链的二聚化形成的所述Fc-TRAIL融合多肽表现出大于或等于65℃的解链温度。8.根据权利要求7所述的多肽链，其中，所述至少一个稳定化突变的位置对应于野生型TRAIL(SEQIDNO：28)的位置247，并且是位于野生型TRAIL的该位置的除异亮氨酸以外的氨基酸。9.根据权利要求8所述的多肽链，其中，所述除异亮氨酸以外的氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸或亮氨酸。10.根据权利要求8所述的多肽链，其中，所述除异亮氨酸以外的氨基酸是缬氨酸(I247V)。11.根据权利要求7所述的多肽链，其中，所述至少一个稳定化突变选自R121I、R130G、Y213W、S215D、N228S和I247V。12.根据权利要求7所述的多肽链，其中，所述至少一个稳定化突变包含选自以下六个组合的至少两个稳定化突变的组合：1)R121I和I247V；2)N228S和I247V；3)R130G和I247V；4)R121I、R130G、Y213W、S215D和I247V；5)R130G、Y213W、S215D和I247V；以及6)R130G、Y213W、S215D、N228S和I247V。13.一种治疗人类患者中的癌症的方法，该方法包括向所述患者施用有效量的通过两个拷贝的权利要求1-12中任一...

【专利技术属性】
技术研发人员：D·H·C·马卡恩托尼奥，S·L·萨辛斯基，B·M·肖伯尔，E·M·塔姆，
申请(专利权)人：梅里麦克制药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：美国,US