一种西瓜枯萎病菌定量检测引物及检测方法技术

本发明专利技术公开了一种用于西瓜枯萎病菌定量检测的引物及引物筛选方法，具体包括引物设计，引物特异性筛选，检测特异性引物FONRT‑18的扩增效率及灵敏度，以及检测实时荧光定量PCR体系的重复性。本发明专利技术建立了Fon的实时荧光PCR定量检测体系，该体系特异性好、灵敏度高、重复性强、准确度高，可检测西瓜枯萎病菌基因组DNA，灵敏度为1.26pg/μL，可快速准确地鉴定出感病植株中的病菌量，为西瓜枯萎病的早期防治提供参考依据。

A Primer and Detection Method for Quantitative Detection of Fusarium oxysporum in Watermelon

The invention discloses a primer and primer screening method for quantitative detection of watermelon Fusarium oxysporum, which includes primer design, primer specific screening, amplification efficiency and sensitivity of detecting specific primer FONRT_18, and repeatability of detecting real-time fluorescent quantitative PCR system. The invention establishes a real-time fluorescent PCR quantitative detection system for Fon, which has good specificity, high sensitivity, strong repeatability and high accuracy. The system can detect genomic DNA of Fusarium oxysporum in watermelon with a sensitivity of 1.26pg/muL, and can quickly and accurately identify the amount of pathogens in susceptible plants, thus providing a reference for early prevention and control of Watermelon Fusarium oxysporum. Basis.

【技术实现步骤摘要】
一种西瓜枯萎病菌定量检测引物及检测方法
本专利技术涉及一种西瓜枯萎病菌定量检测引物及检测方法，属于生物

技术介绍
西瓜枯萎病是由半知菌亚门镰孢属尖孢镰刀菌西瓜专化型(Fusariumoxysporumf.sp.niveum，Fon)引起的一种世界性真菌土传病害，是西瓜生产中产量和品质降低的主要原因之一。由于目前缺乏特效药剂和抗性品种，西瓜枯萎病的防控难度相当大。因此，在植株未出现病症时，对西瓜和土壤中的西瓜枯萎病菌进行定性和定量检测，可以在病菌分生孢子大量扩展和蔓延滋生以前采取有效防控措施，对防治该病害有重要意义。西瓜枯萎病菌检测的传统方法主要包括组织分离、显微镜观察、形态和融合群鉴定，但程序繁琐、周期较长，且无法做到定量检测。因此，亟需一种西瓜枯萎病菌早期检测方法，实现简便、快速和准确地检测西瓜枯萎病菌。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种简便、快速和准确的西瓜枯萎病菌早期检测方法及定量检测引物。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种用于西瓜枯萎病菌定量检测的引物，所述引物FONRT-18的序列如下：FONRT-18-F：TAATGCTCGTAAGTCAGGTTCA；SEQIDNO：1；FONRT-18-R：AGTTGGAGTCAGCGATTTCAT；SEQIDNO：2。进一步，所述引物筛选的方法如下：(1)引物设计：在尖孢镰刀菌基因组数据库中查找西瓜枯萎病基因序列，分别与其他物种的尖孢镰刀菌基因组数据在NCBI进行序列同源性比对，查找尖孢镰刀菌西瓜专化型序列中的特异性位点，进行西瓜枯萎病菌定量检测特异性引物设计；(2)引物特异性筛选：以西瓜枯萎病菌Fonrace0、Fonrace1、Fonrace2、番茄枯萎病菌、黄瓜枯萎病菌、甜瓜枯萎病菌、甘蓝枯萎病菌、棉花枯萎病菌、棉花立枯病菌和棉花黄萎病菌基因组DNA为模板，RNase-freeddH2O为阴性对照，进行西瓜枯萎病菌特异性引物的筛选，筛选出特异性引物FONRT-18；(3)检测特异性引物FONRT-18的扩增效率及灵敏度。所述引物筛选方法还包括：步骤(4)检测实时荧光定量PCR体系的重复性。优选地，步骤(3)所述检测特异性引物FONRT-18的扩增效率及灵敏度的方法如下：以西瓜枯萎病菌1号生理小种基因组DNA为标准品，以10倍浓度梯度连续稀释7次，终浓度为126ng/μL、12.6ng/μL、1.26ng/μL、126pg/μL、12.6pg/μL、1.26pg/μL、126fg/μL、12.6fg/μL，稀释后的工作液为模板进行实时荧光定量PCR反应，反应结束后制作该体系标准曲线，检测该体系扩增效率及灵敏度。优选地，步骤(4)所述检测实时荧光定量PCR体系的重复性的方法如下：利用不同浓度西瓜枯萎病菌1号生理小种基因组DNA，在三个不同时间分别做三次重复试验，记录每次Real-timePCR的Ct值，利用DPS软件对在同一次试验三次重复和三次不同试验间得到的Ct值进行统计学分析，根据变异系数来判断标准曲线的重复性。进一步，一种西瓜枯萎病菌定量检测方法，具体步骤如下：(1)提取感染病菌的西瓜植株基因组DNA；(2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，利用权利要求1所述引物进行实时荧光定量PCR反应；所述实时荧光定量PCR反应体系为：基因组DNA2μL(100ng/μL)，FONRT-18-F0.4μL(10μM)，FONRT-18-R0.4μL(10μM)，2×TransStartTMTopGreenqPCRSuperMix10.4μL，RNase-freeddH2O6.8μL，总体系20μL；所述实时荧光定量PCR扩增程序为：95℃预变性30s；95℃5s，58℃退火15s，72℃延伸10s，共45个循环；最终72℃延伸1min；(3)读取西瓜植株中西瓜枯萎病菌的含量。本专利技术的有益效果是：本专利技术建立了Fon的实时荧光PCR定量检测体系，该体系特异性好、灵敏度高、重复性强、准确度高，可检测西瓜枯萎病菌基因组DNA，灵敏度为1.26pg/μL，可快速准确地鉴定出感病植株中的病菌量，为西瓜枯萎病的早期防治提供参考依据。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。图1附图为本专利技术引物FONRT-18对西瓜枯萎病菌的特异性检测；其中，M：500bpDNAMarker；1：阴性对照；2-4：西瓜枯萎病菌Fusariumoxysporumf.sp.niveum生理小种0，1，2，；5：番茄枯萎病菌Fusariumoxysporumf.sp.lycopersici(Fol)；6：黄瓜枯萎病菌Fusariumoxysporumf.sp.cucumerinum(Focu)；7：甜瓜枯萎病菌Fusariumoxysporumf.sp.melonis(Fom)；8：甘蓝枯萎病菌Fusariumoxysporumf.sp.conglutinans(Foc)；9：棉花枯萎病菌Fusariumoxysporumf.sp.vasinfectum(Fovf)；10：棉花立枯病菌Rhizoctoniasolani；11：棉花黄萎病菌Verticilliumdahliae；图2附图为本专利技术FONRT-18引物Real-TimePCR检测熔解曲线；图3附图为本专利技术FONRT-18引物RT-PCR检测扩增曲线；图4附图为本专利技术引物FONRT-18实时荧光定量PCR标准曲线；图5附图为本专利技术引物FONRT-18普通PCR检测西瓜枯萎病菌基因组DNA灵敏度；其中，M：500bpDNAMarker；1：阴性对照；2～6：将Fonrace1以10倍浓度梯度连续稀释，即12.6ng/μL，1.26ng/μL，126pg/μL，12.6pg/μL，1.26pg/μL，126fg/μL；图6附图为本专利技术引物FONRT-18实时荧光定量PCR灵敏度的扩增曲线；图7附图为本专利技术西瓜‘早佳8424’和‘西农8号’接种枯萎病菌后发病症状；图8附图为本专利技术平板稀释法检测感病植株病菌量的PDA平板；图9附图为本专利技术平板稀释法检测感病西瓜植株枯萎病菌在接种后不同天数菌落数量。具体实施方式下面结合具体实施例来进一步描述本专利技术，本专利技术的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本专利技术的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本专利技术的精神和范围下可以对本专利技术技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本专利技术的保护范围。实施例1育苗西瓜品种选用西瓜枯萎抗性品种‘西农8号’、感病品种‘早佳8424’。育苗的具体步骤如下：(1)将用于育苗和栽培的器皿(穴盘、营养钵)清洗干净，基质(草炭、蛭石、珍珠岩)杀毒灭菌，用杀菌剂和杀虫剂熏棚；(2)将‘西农8号’和‘早佳8424’的西瓜种分别在1.5％NaClO溶液中消毒20min，期间搅动一次；(3)消毒后，用清水冲洗并揉搓，直至水变为无色透明；(4)将消毒后的种子在50～60℃温水本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于西瓜枯萎病菌定量检测的引物，其特征在于，所述引物FONRT‑18的序列如下：FONRT‑18‑F：TAATGCTCGTAAGTCAGGTTCA；FONRT‑18‑R：AGTTGGAGTCAGCGATTTCAT。

【技术特征摘要】
1.一种用于西瓜枯萎病菌定量检测的引物，其特征在于，所述引物FONRT-18的序列如下：FONRT-18-F：TAATGCTCGTAAGTCAGGTTCA；FONRT-18-R：AGTTGGAGTCAGCGATTTCAT。2.根据权利要求1所述的一种用于西瓜枯萎病菌定量检测的引物，其特征在于，所述引物筛选的方法如下：(1)引物设计：在尖孢镰刀菌基因组数据库中查找西瓜枯萎病基因序列，分别与其他物种的尖孢镰刀菌基因组数据在NCBI进行序列同源性比对，查找尖孢镰刀菌西瓜专化型序列中的特异性位点，进行西瓜枯萎病菌定量检测特异性引物设计；(2)引物特异性筛选：以西瓜枯萎病菌Fonrace0、Fonrace1、Fonrace2、番茄枯萎病菌、黄瓜枯萎病菌、甜瓜枯萎病菌、甘蓝枯萎病菌、棉花枯萎病菌、棉花立枯病菌和棉花黄萎病菌基因组DNA为模板，RNase-freeddH2O为阴性对照，进行西瓜枯萎病菌特异性引物的筛选，筛选出特异性引物FONRT-18；(3)检测特异性引物FONRT-18的扩增效率及灵敏度。3.根据权利要求2所述的一种用于西瓜枯萎病菌定量检测的引物，其特征在于，还包括：步骤(4)检测实时荧光定量PCR体系的重复性。4.根据权利要求2或3所述的一种用于西瓜枯萎病菌定量检测的引物，其特征在于，步骤(3)所述检测特异性引物FONRT-18的扩增效率及灵敏度的方法如下：以西瓜枯萎病菌1号生理小种基因组DNA为标准品，以10倍浓度梯度连续稀释7次，终浓度为126ng/μL...

【专利技术属性】
技术研发人员：吕桂云，高洪波，吴晓蕾，李敬蕊，赵静，钟鑫，宫彬彬，
申请(专利权)人：河北农业大学，
类型：发明
国别省市：河北,13