一种鸭大肠杆菌的高密度发酵方法技术

本发明专利技术公开了一种鸭大肠杆菌的高密度发酵方法，以高密度发酵培养基为基础，使用发酵罐进行鸭大肠杆菌高密度发酵。发酵过程中，设定pH7.0～7.5、温度36.5～37.5℃、转速90～420rpm、空气通气量1.2～5.2L/min。接种前流加适量消泡剂，接种后，待细菌OD600nm达到4.0～6.0时，以流速10～25mL/h/L流加45～55(w/v)％葡萄糖溶液，流加葡萄糖的量为每升高密度发酵培养基流加葡萄糖50～100g。本发明专利技术所述的鸭大肠杆菌高密度发酵方法，基于高密度发酵培养基，其营养丰富，通过流加葡萄糖，可实现鸭大肠杆菌高密度发酵，可用于大规模发酵生产鸭大肠杆菌疫苗。

A High Density Fermentation Method for Duck Escherichia coli

The invention discloses a high-density fermentation method for duck Escherichia coli, which is based on a high-density fermentation medium and uses a fermentation tank for high-density fermentation of duck Escherichia coli. In the fermentation process, pH 7.0-7.5, temperature 36.5-37.5 C, rotational speed 90-420 rpm and air ventilation 1.2-5.2 L/min were set. After inoculation, when the OD600 nm of bacteria reached 4.0-6.0, the flow rate was 10-25 mL/h/L and 45-55 (w/v)% glucose solution was added. The amount of added glucose was 50-100 g per high density fermentation medium. The duck E. coli high-density fermentation method of the invention is based on high-density fermentation medium, which is rich in nutrients, can realize high-density fermentation of duck E. coli by adding glucose, and can be used for large-scale fermentation to produce duck E. coli vaccine.

【技术实现步骤摘要】
一种鸭大肠杆菌的高密度发酵方法
本专利技术属于微生物发酵
，具体涉及一种鸭大肠杆菌的高密度发酵方法。
技术介绍
鸭大肠杆菌病由致病性大肠杆菌引起，病理表现主要有急性败血症、气囊炎、全眼球炎、关节滑膜炎、输卵管炎和腹膜炎等。随着养殖规模的不断扩大，水禽饲养水域环境的不断恶化，大肠杆菌病已成为目前危害水禽养殖较为严重的细菌传染病之一。由于目前临床上广泛使用抗生素治疗大肠杆菌等细菌性疾病，导致大量耐药菌株的产生，因此，在大肠杆菌防治中使用疫苗免疫接种是行之有效的预防途径。对于细菌疫苗，如何提高细菌菌数(即抗原含量)是细菌疫苗研究的关键技术之一。一般而言，抗原含量高的疫苗免疫机体后，能产生较高的抗体水平，抗体持续时间也较长。细菌高密度发酵技术业已成为细菌疫苗制备中常用的培养技术手段，该技术可提高单位体积培养液中菌体的浓度，进而提高体积产率。致病性大肠杆菌为兼性厌氧菌，对培养条件要求不高，在普通的LB肉汤培养基中均能正常生长，然而难以实现其高密度发酵，致病性鸭大肠杆菌高密度发酵更是鲜有报道。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一种鸭大肠杆菌的高密度发酵方法，该方法可实现致病性鸭大肠杆菌大规模高密度发酵，有效提高体积产率，降低生产成本。本专利技术所采取的技术方案是：一种鸭大肠杆菌的高密度发酵方法，包括以下步骤：将鸭大肠杆菌接种至高密度发酵培养基中进行发酵，发酵过程中，调节发酵液pH为7.0～7.5、发酵温度为36.5～37.5℃、搅拌转速90～420rpm、发酵液中空气通气量为1.2～5.2L/min；当发酵液OD600nm达到4.0～6.0时流加葡萄糖溶液，当发酵液的OD600nm值停止增长时，结束发酵；所述高密度发酵培养基配方为：每升水中含有酵母浸出物30.0～40.0g，胰蛋白胨5.0～15.0g，大豆蛋白胨5.0～15.0g，水解乳蛋白5.0～10.0g，酪蛋白胨5.0～10.0g，胃蛋白胨4.0～7.0g，麦芽浸粉1.0～3.0g，磷酸氢二钾2.0～5.0g，甘油1.0～3.0mL，铁盐2.0～10.0mg，锰盐2.0～10.0mg，铝盐2.0～10.0mg。进一步的，在接种前，先往高密度发酵培养基中加入适量消泡剂。进一步的，流加葡萄糖溶液的速度为10～25mL/h/L。进一步的，所述葡萄糖溶液的浓度为45～55(w/v)％。进一步的，流加葡萄糖的量为每升高密度发酵培养基流加葡萄糖50.0～100.0g。进一步的，所述铁盐选自硝酸铁、氯化铁、硫酸铁中的至少一种。进一步的，所述锰盐选自硫酸锰、氯化锰中的至少一种。进一步的，所述铝盐选自硫酸铝、氯化铝中的至少一种。进一步的，鸭大肠杆菌的接种量为2％～10％。进一步的，发酵起始搅拌转速为90～120rpm，发酵液中空气通气量为1.2～1.7L/min；发酵0.4～0.6h后搅拌转速为130～170rpm，发酵液中空气通气量为1.8～2.2L/min；发酵0.8～1.2h后搅拌转速为180～220rpm，发酵液中空气通气量为2.8～3.2L/min；发酵1.8～2.2h后搅拌转速为280～320rpm，发酵液中空气通气量为3.8～4.2L/min；发酵2.8～3.2h后搅拌转速为380～420rpm，发酵液中空气通气量为4.8～5.2L/min。本专利技术的有益效果是：(1)本专利技术方法使用的鸭大肠杆菌高密度发酵培养基极利于致病性鸭大肠杆菌的生长，且配制方法简单，便于大规模生产使用。(2)本专利技术鸭大肠杆菌高密度发酵方法，以特定的高密度发酵培养基为发酵培养基，并在发酵的过程中通过特定的方式流加葡萄糖，可实现鸭大肠杆菌高密度发酵，可用于大规模生产鸭大肠杆菌疫苗。本专利技术的鸭大肠杆菌高密度发酵方法可有效提高单位体积培养液中菌体的浓度，进而提高体积产率，降低生产成本。附图说明图1鸭大肠杆菌在四种实施例中的生长曲线。实施例1：即高密度发酵方法优选实施例；对比例1：即以高密度发酵培养基为基础，未流加葡萄糖；对比例2：即以LB肉汤培养基为基础，流加葡萄糖；对比例3：即以LB肉汤培养基为基础，未流加葡萄糖。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术作进一步的说明。本专利技术提供了一种鸭大肠杆菌的高密度发酵方法，以高密度发酵培养基进行鸭大肠杆菌高密度发酵。在发酵过程中采用恒速补料法流加葡萄糖，通过控制空气通气量、pH、温度、转速以及葡萄糖流速，使细菌实现高密度发酵。本专利技术对于鸭大肠杆菌的来源及血清型没有特殊限制，在本专利技术具体实施例中，采用的鸭大肠杆菌为O78血清型鸭大肠杆菌强毒株。鸭大肠杆菌的生长状况与现有实验室工程菌(如重组大肠杆菌)不同，现有培养条件很难实现鸭大肠杆菌强毒株的高密度发酵。本专利技术对于pH调节试剂(酸和碱)以及消泡剂的种类与配置方法无特殊限定，采用本
常规试剂以及配制方法即可。在本专利技术具体实施例中，鸭大肠杆发酵用种子菌液采用各自实施例中对应的发酵培养基进行培养。首先进行鸭大肠杆菌种子菌的复苏，从—80℃冰箱中取出O78血清型鸭大肠杆菌强毒株，解冻后划线接种于LB普通琼脂培养基上，置于37℃培养箱培养12～16小时。其次进行鸭大肠杆菌发酵用种子菌液的准备，使用接种环挑取LB普通琼脂平板上鸭大肠杆菌单克隆菌落，分别接种于5mL各自实施例或对比例中对应的发酵培养基中，37℃摇床，180rpm条件下培养12～16小时。按1:100比例，取1mL培养的单克隆菌液再分别接种于100mL各自实施例中对应的发酵培养基中，37℃摇床，180rpm条件下培养至对数生长期，种子菌起始浓度OD600nm控制在1.0～3.0之间，以此作为发酵用种子菌，按2％～10％的比例接种至含有各自实施例对应发酵培养基的发酵罐内进行发酵。以下结合本专利技术的优选实施例进行详细的说明(使用赛多利斯5L发酵罐进行)。实施例1比较鸭大肠杆菌(O78血清型)在四种不同发酵方法的条件下细菌的生长曲线以及菌体形态。四种发酵方法的差异情况如下表所示：表1四种发酵方法的差异情况实施例1以本专利技术高密度发酵培养基为基础，流加葡萄糖对比例1以本专利技术高密度发酵培养基为基础，未流加葡萄糖对比例2以LB肉汤培养基为基础，流加葡萄糖对比例3以LB肉汤培养基为基础，未流加葡萄糖实施例1的具体发酵方法如下(培养基体积为1L)：(1)配制优选的鸭大肠杆菌高密度发酵培养基以及相关试剂，进行发酵罐的灭罐处理与组装：a.优选的高密度发酵培养基：配制培养基体积1L，称取酵母浸出物40.0g，胰蛋白胨10.0g，大豆蛋白胨10.0g，水解乳蛋白5.0g，酪蛋白胨10.0g，胃蛋白胨5.0g，麦芽浸粉2.0g，磷酸氢二钾5.0g，甘油2.0mL，硝酸铁5.0mg，硫酸锰5.0mg，硫酸铝5.0mg，将上述各组分加热溶解定容于1L水中，转入5L赛多利斯发酵罐，121℃高压灭菌15min。b.2M硫酸溶液：量取98％浓硫酸109mL，缓慢加入800mL水中，待冷却后加水定容至1L体积，转入发酵罐酸泵补料瓶中，121℃高压灭菌15min。c.6M氨水溶液：量取纯氨水溶液230mL，加水定容至1L，0.22um滤器过滤除菌，无菌操作，转入灭菌后碱泵补料瓶中。d.1(v/v)％204消泡剂溶液：量取1mL204消泡剂，定容于1L水中，转入发酵罐消泡泵补料瓶中，121℃本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种鸭大肠杆菌的高密度发酵方法，其特征在于，包括以下步骤：将鸭大肠杆菌接种至高密度发酵培养基中进行发酵，发酵过程中，调节发酵液pH为7.0～7.5、发酵温度为36.5～37.5℃、搅拌转速90～420rpm、发酵液中空气通气量为1.2～5.2L/min；当发酵液OD600nm达到4.0～6.0时流加葡萄糖溶液，当发酵液的OD600nm值停止增长时，结束发酵；所述高密度发酵培养基配方为：每升水中含有酵母浸出物30.0～40.0g，胰蛋白胨5.0～15.0g，大豆蛋白胨5.0～15.0g，水解乳蛋白5.0～10.0g，酪蛋白胨5.0～10.0g，胃蛋白胨4.0～7.0g，麦芽浸粉1.0～3.0g，磷酸氢二钾2.0～5.0g，甘油1.0～3.0mL，铁盐2.0～10.0mg，锰盐2.0～10.0mg，铝盐2.0～10.0mg。

【技术特征摘要】
1.一种鸭大肠杆菌的高密度发酵方法，其特征在于，包括以下步骤：将鸭大肠杆菌接种至高密度发酵培养基中进行发酵，发酵过程中，调节发酵液pH为7.0～7.5、发酵温度为36.5～37.5℃、搅拌转速90～420rpm、发酵液中空气通气量为1.2～5.2L/min；当发酵液OD600nm达到4.0～6.0时流加葡萄糖溶液，当发酵液的OD600nm值停止增长时，结束发酵；所述高密度发酵培养基配方为：每升水中含有酵母浸出物30.0～40.0g，胰蛋白胨5.0～15.0g，大豆蛋白胨5.0～15.0g，水解乳蛋白5.0～10.0g，酪蛋白胨5.0～10.0g，胃蛋白胨4.0～7.0g，麦芽浸粉1.0～3.0g，磷酸氢二钾2.0～5.0g，甘油1.0～3.0mL，铁盐2.0～10.0mg，锰盐2.0～10.0mg，铝盐2.0～10.0mg。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在接种前，先往高密度发酵培养基中加入适量消泡剂。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，流加葡萄糖溶液的速度为10～25mL/h/L。4.根据权利要求1或3所述的方法，其特征在于，所述葡萄糖溶液的浓度为45～...

【专利技术属性】
技术研发人员：龚凤平，袁建丰，马海彬，罗梦萍，
申请(专利权)人：广东海大畜牧兽医研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44