本发明专利技术提供一种重组人SOD‑生长因子融合蛋白、其制备方法及其应用。所述融合蛋白由与人SOD至少85％序列同源的第一区和与人生长因子至少85％序列同源的第二区组成，第一区与第二区之间设有连接肽(GGGGS)n，其中n＝1～5，优选n＝3。本发明专利技术还涉及编码所述融合蛋白的核苷酸序列、携带该核苷酸序列的重组细胞。该融合蛋白可以在不改变融合蛋白特性的前提下，进行个别氨基酸残基的取代、缺失或加入。本发明专利技术的重组人SOD‑生长因子融合蛋白兼具人SOD和人生长因子的特性，复配以适当辅料后，可进一步制备成冻干粉剂、纳米微球、纳米脂质体、水剂、凝胶等半固体制剂，作为活性添加剂应用于组织工程、药学以及美容护肤领域。
Recombinant human SOD-growth factor fusion protein, its preparation method and Application
The invention provides a recombinant human SOD growth factor fusion protein, a preparation method and application thereof. The fusion protein consists of the first region homologous to at least 85% of the human SOD sequence and the second region homologous to at least 85% of the human growth factor sequence. The invention also relates to a nucleotide sequence encoding the fusion protein and a recombinant cell carrying the nucleotide sequence. The fusion protein can replace, delete or add individual amino acid residues without changing the characteristics of the fusion protein. The recombinant human SOD growth factor fusion protein has the characteristics of human SOD and human growth factor, and can be further prepared into semisolid preparations such as lyophilized powder, nanospheres, nano liposomes, water and gel, etc. after being combined with suitable excipients, as an active additive, it can be applied to tissue engineering, pharmacy and cosmetic skin care collar. Domain.
【技术实现步骤摘要】
重组人SOD-生长因子融合蛋白、其制备方法及其应用
本专利技术涉及到基因工程领域，通过基因重组的方法获得了重组人SOD-生长因子融合蛋白。本专利技术还涉及所述重组人SOD-生长因子融合蛋白在组织工程、药学以及美容护肤领域中的应用。
技术介绍
1938年Marn等人首次从牛红血球中分离得到超氧化物歧化酶，直到1969年McCord等重新发现这种蛋白的生物活性，被正式命名为超氧化物歧化酶(SuperoxideDismutase，SOD)。超氧化物歧化酶广泛存在于各种生命体中，是体内对抗自由基的第一道防线，它可以将O2-歧化为H2O2和O2，而H2O2可被过氧化氢酶催化分解，最终清除O2-。SOD对O2-的及时清除保证了机体内O2-的相对平衡，但由于体内的SOD随着年龄的增加而逐渐减少，再加上环境的恶化，大量自由基超过身体负荷，机体在自由基清除不足和抗氧化能力下降的情况下，产生系列连锁放大反应，正常细胞被损坏，从而引发衰老或疾病，因此外源补充成为必要。SOD作为一种生物酶制剂，在抗氧化应激、抗炎、抗衰老、抑制肿瘤等方面有重要作用，广泛应用于临床和科研上，由于它具有抗氧化的优良性能，可添加在化妆品中，以SOD为主要成分的产品一时成为风靡，但一般的微生物、动植物中提取出来的SOD稳定性差，不耐高温和酸，随着生物技术的发展，利用基因工程技术生产SOD，其产率、质量、安全性得到提高，但技术瓶颈仍然是其稳定性差，难以长期保持活性。因此，本领域中亟需开发稳定性好、半衰期长、活性优的SOD蛋白衍生物，以满足应用需求。
技术实现思路
本专利技术涉及一种重组人SOD-生长因子融合蛋白、其制备方法及其应用。本专利技术还涉及编码所述融合蛋白的核苷酸序列，携带该核苷酸序列的重组细胞，例如，细菌、酵母、动物细胞、植物细胞。本专利技术的重组人SOD生长因子融合蛋白的半衰期较单独的SOD长，活性优于单独的SOD，不仅能迅速清除创伤部位的大量自由基，同时促进创伤部位血管和神经的修复再生，提高免疫，加速止血、愈合，活性保存时间长，不易丧失。本专利技术获得的重组人SOD-生长因子融合蛋白纯度达95％以上，兼具人SOD和人生长因子的特性，复配以适当辅料后，可进一步制备成冻干粉剂、纳米微球、纳米脂质体、水剂、凝胶等半固体制剂，作为活性添加剂应用于组织工程、药学以及美容护肤领域。该重组人SOD-生长因子融合蛋白具有人源化，免疫原性低，不易发生过敏反应的突出优点。在第一方面，本专利技术提供一种重组人SOD-生长因子融合蛋白，所述融合蛋白由第一区和第二区组成，其中第一区与人SOD至少85％序列同源，第二区与人生长因子至少85％序列同源。并且所述第一区与第二区之间设有连接肽，所述连接肽的通式是(GGGGS)n，其中n＝1～5，优选n＝3。优选地，第一区与人SOD至少90％、更优选至少95％、甚至至少99％序列同源，第二区与人生长因子至少90％、更优选至少95％、甚至至少99％序列同源。更优选地，第一区为人SOD，第二区为人生长因子。并且，在不改变融合蛋白特性的前提下，进行个别氨基酸残基的取代、缺失或加入所得到的融合蛋白的衍生物也在本专利技术的范围内。在优选的实施方案中，所述重组人SOD-生长因子融合蛋白由第一区和第二区组成，其中第一区为人SOD，第二区为人生长因子，并且所述第一区与第二区之间的连接肽为(GGGGS)n，其中n＝1～5，优选n＝3。在本专利技术的某些实施方案中，提供了一种重组人SOD-生长因子融合蛋白，其特征在于该融合蛋白可以在不改变融合蛋白特性的前提下，进行个别氨基酸残基的取代、缺失或加入。在本专利技术的某些实施方案中，提供了一种重组人SOD-生长因子融合蛋白，其特征在于所述与人SOD同源的第一区位于融合蛋白的N-末端，与人生长因子同源的第二区位于融合蛋白的C-末端，第一区和第二区之间的连接肽为(GGGGS)n，其中n＝1～5，优选n＝3。根据本专利技术的某些实施方案中的一个方面，提供的上述任何一项所述的融合蛋白，其特征在于所述的人生长因子选自aFGF、bFGF、EGF或NGF。在优选的实施方案中，所述人生长因子为bFGF。在更优选的实施方案中，在所述重组人SOD-生长因子融合蛋白中，第一区为人SOD，第二区为人aFGF(人酸性成纤维生长因子)。其中第一区位于融合蛋白的N-末端，第二区位于融合蛋白的C-末端，二者通过连接肽(GGGGS)n连接，其中n为3。具体地，所述重组人SOD-生长因子融合蛋白的氨基酸序列为SEQIDNo.1所示。在第二方面，本专利技术提供编码本专利技术第一方面的重组人SOD-生长因子融合蛋白的核苷酸序列。优选地，当第一区为人SOD，第二区为人aFGF，并且其中第一区位于融合蛋白的N-末端，第二区位于融合蛋白的C-末端，第一区和第二区通过连接肽(GGGGS)3连接，所述编码核苷酸序列为SEQIDNo.2或3。其中SEQIDNo.2具有大肠杆菌密码子偏好性，SEQIDNo.3具有酵母密码子偏好性，分别适合在大肠杆菌和酵母细胞中表达所述融合蛋白。在第三方面，本专利技术提供了一种包含重组人SOD-生长因子融合蛋白的编码核苷酸序列的重组细胞，所述细胞可以选自细菌、酵母、动物细胞或植物细胞，其中优选酵母或大肠杆菌细胞，酵母细胞优选是毕赤酵母细胞。在第四方面，本专利技术提供所述重组人SOD-生长因子融合蛋白的应用。本专利技术的融合蛋白复配以适当辅料后，可进一步制备成冻干粉剂、纳米微球、纳米脂质体、水剂、凝胶等半固体制剂，作为活性添加剂应用于组织工程、药学以及美容护肤领域。在第五方面，本专利技术提供一种活性添加剂，其包含本专利技术所述的重组人SOD-生长因子融合蛋白。所述添加剂中还可以复配以适当的辅料，应用于组织工程、药学以及美容护肤领域。并且，所述添加剂可以与适当的辅料进一步制备成冻干粉剂、纳米微球、纳米脂质体、水剂、凝胶等半固体制剂。附图说明从下面结合附图的详细描述中，本专利技术的上述特征和优点将更明显，其中：图1.(A)重组hSOD1-haFGF融合基因的获得，引物F1/R1用于扩增基因hSOD1，5’端加了BamHI酶切位点，3’端加了编码接头GGGGS的核苷酸序列，F2/R2用于扩增基因hSOD1，3’端加了EcoRI酶切位点，5’端加了编码接头GGGGS的核苷酸序列，用F1/R1和F2/R2扩增的两个基因作模板，用F1/R2扩增就能得到融合基因；(B)重组质粒pET28a-hSOD1-haFGF的构建示意图。图2.编码融合蛋白的核苷酸的PCR验证。泳道1：DL2000；泳道2：编码融合蛋白的核苷酸片段，约为900bp(理论值为933bp)。图3.在大肠杆菌中表达的融合蛋白的SDS-PAGE电泳图。泳道1：分子量Marker；泳道2-3：融合蛋白。图4.蛋白质印迹结果。(A)和(B)分别为haFGF和hSOD1。图5.琼脂糖凝胶电泳图。泳道1：分子量Marker；泳道2：重组质粒pPIC9k-hSOD1-haFGF；泳道3：hSOD1-haFGF融合基因片段。图6.在酵母中表达的融合蛋白的SDS-PAGE电泳图，泳道M：分子量Marker；泳道1：融合蛋白。图7.重组pPIC9k-hSOD1-haFGF图谱。图8.WST-1法测定SOD活性的原理。图9.单独的SOD(◇)和本专利技术的重组S本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种重组人SOD‑生长因子融合蛋白，其由第一区和第二区组成，其中第一区为人SOD，第二区为人生长因子，并且所述第一区与第二区之间设有连接肽，所述连接肽的通式是(GGGGS)n，其中n＝1～5，优选n＝3。
【技术特征摘要】
1.一种重组人SOD-生长因子融合蛋白，其由第一区和第二区组成，其中第一区为人SOD，第二区为人生长因子，并且所述第一区与第二区之间设有连接肽，所述连接肽的通式是(GGGGS)n，其中n＝1～5，优选n＝3。2.根据权利要求1所述的重组人SOD-生长因子融合蛋白，其中第一区位于所述融合蛋白的N-末端，第二区位于所述融合蛋白的C-末端。3.根据权利要求1所述的重组人SOD-生长因子融合蛋白，其特征在于所述人生长因子选自aFGF、bFGF、EGF或NGF，优选为bFGF。4.根据权利要求1所述的重组人SOD-生长因子融合蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNo.1所示。5.编码权利要求1-4任一项的融合蛋白的核苷酸序列。6....
【专利技术属性】
技术研发人员：黄亚东，项琪，肖巧学，
申请(专利权)人：广州暨南大学医药生物技术研究开发中心，肽源广州生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。