信号肽优化靶向CD19的嵌合抗原受体、表达该嵌合抗原受体的T细胞及制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种信号肽优化靶向CD19的嵌合抗原受体、表达该嵌合抗原受体的T细胞及制备方法和应用，所述信号肽优化靶向CD19的嵌合抗原受体包含顺序串联的跨膜蛋白信号肽、抗CD19抗体单链可变区、CD8蛋白分子的铰链区、跨膜区、4‑1BB共刺激结构域与CD3ζ胞内信号传导结构域，其中，所述跨膜蛋白信号肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1或SEQ ID No.2或SEQ ID No.3所示，该嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID No.11或SEQ ID No.12或SEQ ID No.13所示，该靶向CD19的嵌合抗原受体在T细胞中更加高效、稳定表达，以更好地发挥对靶细胞的杀伤作用。

Optimizing chimeric antigen receptor targeting CD19 by signal peptide, T cell expressing chimeric antigen receptor, preparation method and Application

The invention discloses a chimeric antigen receptor targeting CD19 optimized by a signal peptide, a T cell expressing the chimeric antigen receptor, a preparation method and application. The chimeric antigen receptor targeting CD19 optimized by the signal peptide includes a sequence of tandem transmembrane protein signal peptide, a single chain variable region of anti-CD19 antibody, a hinge region and a span of CD8 protein molecule. Membrane region, 4_1BB costimulatory domain and CD3_intracellular signal transduction domain, in which the amino acid sequence of the transmembrane protein signal peptide is shown as SEQ ID No.1 or SEQ ID No.2 or SEQ ID No.3, and the amino acid sequence of the chimeric antigen receptor is shown as SEQ ID No.11 or SEQ ID No.12 or SEQ ID No.13, and the targeting CD19. Chimeric antigen receptors are expressed more efficiently and stably in T cells in order to play a better role in killing target cells.

【技术实现步骤摘要】
信号肽优化靶向CD19的嵌合抗原受体、表达该嵌合抗原受体的T细胞及制备方法和应用
本专利技术是关于免疫学与分子生物学
，特别是关于一种信号肽优化靶向CD19的嵌合抗原受体、表达该嵌合抗原受体的T细胞及制备方法和应用。
技术介绍
过继性免疫细胞治疗(adoptivecelltherapy,ACT)是指从肿瘤患者分离免疫活性细胞，在体外进行扩增与功能鉴定后，然后再回输给患者，从而直接杀伤肿瘤或激发机体的免疫应答杀伤肿瘤细胞。免疫治疗(Immunotherapy)是继手术、放疗、化疗之后的第四种肿瘤治疗方法。嵌合抗原受体(chimericantigenreceptor,CAR)T细胞技术是新近迅速发展的一种细胞免疫治疗技术，CAR是一个人工合成的融合受体，在结构上包括胞外抗原结合区、跨膜区、胞内信号转导区与共刺激信号区。胞外区为识别肿瘤相关抗原的单克隆抗体可变区序列(singlechainvariablefragment，ScFV)，跨膜区连接胞外区与胞内区，常用的跨膜区分子有CD3、CD4、CD8与CD28等，胞内区具有免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)，最常用的是T细胞受体TCR/CD3ζ链和免疫球蛋白FC受体FCεRIγ，主要负责信号转导功能；人们通过分子克隆方法将上述元件在体外进行重组，形成重组质粒，通过病毒载体、电穿孔等手段将重组质粒转导入T细胞，继之在体外培养扩增，最后回输到病人体内，起到治疗肿瘤的目的，这种经过基因修饰与改造的T细胞即称为CAR-T细胞。CAR-T细胞通过ScFV段识别并结合肿瘤抗原，再通过CD3ζ链和共刺激信号区激活T细胞，这样改造的CAR-T细胞识别、杀伤肿瘤细胞就具有了两大特点：①靶向性；②克服了MHC限制性，即不再依赖MHC，因此突破了肿瘤细胞通过下调MHC的表达而发生免疫逃逸这一难题。鉴于CAR-T技术的优势，近年来该技术发展迅猛。2017年8月31日，诺华(Novartis)公司突破性CAR-T细胞疗法Kymriah(tisagenlecleucel，曾用名CTL019)获得FDA批准上市，这是人类历史上首款CAR-T细胞疗法，适应症是急性B淋巴细胞白血病(B-ALL)的25岁以下患者。2017年10月18日，美国FDA批准了KitePharma的CAR-T疗法Yescarta(axicabtageneciloleucel)上市，适应症是特定类型的非霍奇金淋巴瘤。信号肽是指引导新合成的肽链跨越细胞膜的一小段多肽，一般由15-30个氨基酸残基组成，位于新合成肽链的N端。它不仅能引导分泌蛋白或膜蛋白出胞，还能引导蛋白质在细胞内不同区域进行正确定位。信号肽在外源蛋白的表达中起重要作用，选择合适的信号肽能够促进重组蛋白的表达。嵌合抗原受体是跨膜蛋白，当它在T细胞中表达后，依赖于胞外的ScFV段识别靶抗原。已经有文献报道信号肽可影响CAR的表达，Seogkyoung等在构建IL13RCAR-T的过程中发现，以VHCAMP的信号肽作为CAR的信号肽，CAR的表达量为78.8％，以hIL3信号肽作为CAR的信号肽，CAR的表达量为14.9％，说明信号肽的选择对CAR的构建至关重要。公开于该
技术介绍
部分的信息仅仅旨在增加对本专利技术的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种信号肽优化靶向CD19的嵌合抗原受体、表达该嵌合抗原受体的T细胞及制备方法和应用，其能够使得靶向CD19的嵌合抗原受体在T细胞中更加高效、稳定表达，以更好地发挥对靶细胞的杀伤作用。为实现上述目的，本专利技术提供了一种信号肽优化靶向CD19的嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包含顺序串联的跨膜蛋白信号肽、抗CD19抗体单链可变区、CD8蛋白分子的铰链区、跨膜区、4-1BB共刺激结构域与CD3ζ胞内信号传导结构域，其中，所述嵌合抗原受体的N-端以跨膜蛋白信号肽与抗CD19抗体单链可变区的重链可变区相连接，该跨膜蛋白信号肽的氨基酸序列如SEQIDNo.1或SEQIDNo.2或SEQIDNo.3所示，该嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQIDNo.11或SEQIDNo.12或SEQIDNo.13所示，其中，分别包含跨膜蛋白信号肽氨基酸序列SEQIDNo.1、SEQIDNo.2和SEQIDNo.3的嵌合抗原受体的氨基酸序列依次对应于SEQIDNo.11、SEQIDNo.12和SEQIDNo.13，即在跨膜蛋白信号肽的氨基酸序列如SEQIDNo.1所示时，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQIDNo.11所示；在跨膜蛋白信号肽的氨基酸序列如SEQIDNo.2所示时，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQIDNo.12所示；在跨膜蛋白信号肽的氨基酸序列如SEQIDNo.3所示时，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQIDNo.13所示。本专利技术选取了上述三种跨膜蛋白信号肽(CD8信号肽(SEQIDNo.1)、GM-CSFR信号肽(SEQIDNo.2)与免疫球蛋白轻链К信号肽(SEQIDNo.3))，对靶向CD19的抗原受体序列进行了优化，以使CD19CAR(即，靶向CD19的抗原受体)在T细胞中更加稳定高效表达，进而更好地发挥对靶细胞的杀伤作用。在一优选的实施方式中，所述抗CD19抗体单链可变区的轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNo.4所示，重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNo.5所示，轻重链之间的连接区的氨基酸序列如SEQIDNo.6所示；所述CD8蛋白分子的铰链区的氨基酸序列如SEQIDNo.7所示。在一优选的实施方式中，所述嵌合抗原受体的跨膜区的氨基酸序列如SEQIDNo.8所示，所述4-1BB共刺激结构域的氨基酸序列如SEQIDNo.9所示，所述CD3ζ胞内信号传导结构域的氨基酸序列如SEQIDNo.10所示。本专利技术还提供了表达上述嵌合抗原受体的T细胞。本专利技术还提供了上述T细胞的制备方法，包括以下步骤：(1)靶向CD19的嵌合抗原受体慢病毒载体的获得；(2)靶向CD19的嵌合抗原受体慢病毒的制备及效价测定；(3)进而用步骤(2)制备好的靶向CD19的嵌合抗原受体慢病毒感染T细胞，以完成靶向CD19的嵌合抗原受体T细胞制备。在一优选的实施方式中，所述靶向CD19的嵌合抗原受体慢病毒载体的获得包括以下步骤：(1)合成靶向CD19的嵌合抗原受体的基因序列：合成跨膜蛋白信号肽、抗CD19抗体单链可变区、CD8蛋白分子的铰链区、跨膜区、4-1BB共刺激结构域与CD3ζ胞内信号传导结构域的基因序列；(2)构建表达嵌合抗原受体的慢病毒载体。在一优选的实施方式中，上述步骤(1)中所述嵌合抗原受体的基因序列如SEQIDNo.22或SEQIDNo.23或SEQIDNo.24所示。在一优选的实施方式中，所述靶向CD19的嵌合抗原受体慢病毒制备及效价测定包括以下步骤：(1)第0天铺板：0.25％胰酶消化293T细胞，铺在含有10mlDMEM(含有10％FBS)的10cm培养皿中，于37℃，5％CO2恒温培养箱培养，保证24h后细胞汇合度达到90-95％；(2)293T细胞转染：转染前2小时，将293T细胞换液，将靶向CD19的嵌合抗原受体慢病毒载体以本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种信号肽优化靶向CD19的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体包含顺序串联的跨膜蛋白信号肽、抗CD19抗体单链可变区、CD8蛋白分子的铰链区、跨膜区、4‑1BB共刺激结构域与CD3ζ胞内信号传导结构域，其中，所述嵌合抗原受体的N‑端以跨膜蛋白信号肽与抗CD19抗体单链可变区的重链可变区相连接，该跨膜蛋白信号肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1或SEQ ID No.2或SEQ ID No.3所示，该嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID No.11或SEQ ID No.12或SEQ ID No.13所示，其中，分别包含跨膜蛋白信号肽氨基酸序列SEQ ID No.1、SEQ ID No.2和SEQ ID No.3的嵌合抗原受体的氨基酸序列依次对应于SEQ ID No.11、SEQ ID No.12和SEQ ID No.13。

【技术特征摘要】
1.一种信号肽优化靶向CD19的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体包含顺序串联的跨膜蛋白信号肽、抗CD19抗体单链可变区、CD8蛋白分子的铰链区、跨膜区、4-1BB共刺激结构域与CD3ζ胞内信号传导结构域，其中，所述嵌合抗原受体的N-端以跨膜蛋白信号肽与抗CD19抗体单链可变区的重链可变区相连接，该跨膜蛋白信号肽的氨基酸序列如SEQIDNo.1或SEQIDNo.2或SEQIDNo.3所示，该嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQIDNo.11或SEQIDNo.12或SEQIDNo.13所示，其中，分别包含跨膜蛋白信号肽氨基酸序列SEQIDNo.1、SEQIDNo.2和SEQIDNo.3的嵌合抗原受体的氨基酸序列依次对应于SEQIDNo.11、SEQIDNo.12和SEQIDNo.13。2.如权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述抗CD19抗体单链可变区的轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNo.4所示，重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNo.5所示，轻重链之间的连接区的氨基酸序列如SEQIDNo.6所示；所述CD8蛋白分子的铰链区的氨基酸序列如SEQIDNo.7所示。3.如权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体的跨膜区的氨基酸序列如SEQIDNo.8所示，所述4-1BB共刺激结构域的氨基酸序列如SEQIDNo.9所示，所述CD3ζ胞内信号传导结构域的氨基酸序列如SEQIDNo.10所示。4.表达权利要求1-3任一项所述的嵌合抗原受体的T细胞。5.如权利要求4所述的T细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)靶向CD19的嵌合抗原受体慢病毒载体的获得；(2)靶向CD19的嵌合抗原受体慢病毒的制备；(3)用步骤(2)制备好的靶向CD19的嵌合抗原受体慢病毒感染T细胞，以完成靶向CD19的嵌合抗原受体T细胞制备。6.如权利要求5所述的T细胞的制备方法，其特征在于，所述靶向CD19的嵌合抗原受体慢病毒载体的获得包括以下步骤：(1)合成靶向CD19的嵌合抗原受体的基因序列：合成跨膜蛋白信号肽、抗CD19抗体单链可变区、CD8蛋白分子的铰链区、跨膜区、4-1BB共...

【专利技术属性】
技术研发人员：李香群，盖丽云，李政利，李刚毅，
申请(专利权)人：北京多赢时代科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11