本发明专利技术公开了一种胸膜肺炎放线杆菌免疫保护性抗原蛋白APJL_0922及其应用。本发明专利技术胸膜肺炎放线杆菌免疫保护性抗原蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，该免疫保护性抗原蛋白由273个氨基酸组成，其成熟多肽部分为20‑273位氨基酸。编码该免疫保护性抗原蛋白的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.2所示。本发明专利技术的免疫保护性抗原蛋白具有很好的免疫原性和免疫保护作用强，其具有制备用于检测胸膜肺炎放线杆菌抗体的试剂盒的应用、制备猪胸膜肺炎亚单位疫苗的应用、制备用于预防由胸膜肺炎放线杆菌引起的疾病的药物的应用。本发明专利技术为制备猪胸膜肺炎亚单位疫苗提供了新的材料，对猪胸膜肺炎的防制具有重要意义。
【技术实现步骤摘要】
一种胸膜肺炎放线杆菌免疫保护性抗原蛋白APJL_0922及其应用
本专利技术涉及动物传染病亚单位疫苗制备
，具体涉及一种胸膜肺炎放线杆菌免疫保护性抗原蛋白APJL_0922及其应用。
技术介绍
胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacilluspleuropneumoniae)是一种革兰氏阴性菌小杆菌，是引起猪胸膜肺炎的病原菌。猪胸膜肺炎是一种高度接触传染的呼吸道疾病，以急性出血性、纤维素性、坏死性支气管肺炎和纤维素性胸膜炎为主要特征，自1957年Pattison等首次报道以来，该病已遍布全球多个国家和地区，严重阻碍养猪业的健康发展。疫苗免疫是预防和控制猪胸膜肺炎的有效手段。猪胸膜肺炎亚单位疫苗通常是以经鉴定的胸膜肺炎放线杆菌免疫保护性抗原蛋白为基础，通过适当处理制成的疫苗制剂。亚单位疫苗使用安全，能激发动物产生高水平抗目的抗原蛋白的抗体，为动物提供一定的保护。但是目前，可被人们用来生产猪胸膜肺炎亚单位疫苗的免疫保护性抗原蛋白数量较少，很大程度上限制了猪胸膜肺炎亚单位疫苗的改进和发展。因此，发掘新的免疫保护性抗原蛋白，对开发高效猪胸膜肺炎亚单位疫苗和该病的控制具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种新型的胸膜肺炎放线杆菌免疫保护性抗原蛋白APJL_0922。本专利技术的目的还在于提供所述免疫保护性抗原蛋白APJL_0922的应用。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种胸膜肺炎放线杆菌免疫保护性抗原蛋白APJL_0922，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，该免疫保护性抗原蛋白由273个氨基酸组成，其成熟多肽部分为20-273位氨基酸。编码该免疫保护性抗原蛋白的核苷酸序列优选如SEQIDNO.2所示。一种重组表达载体，包含所述免疫保护性抗原蛋白成熟多肽的编码序列。一种重组工程菌，为包含所述重组表达载体的大肠杆菌。所述胸膜肺炎放线杆菌免疫保护性抗原的制备方法，包括以下步骤：(1)构建包含所述免疫保护性抗原蛋白或其成熟多肽编码序列的重组表达载体；所述的重组表达载体的骨架载体优选为pGEX-KG。(2)将所述重组表达载体转化到宿主细胞中；所述的宿主细胞优选为大肠杆菌；(3)培养所述经转化的宿主细胞并诱导其表达所述免疫保护性抗原；所述的培养、诱导的条件优选为：将经转化的宿主细胞在37℃培养至OD600为0.6-0.7时，加入IPTG至终浓度1.0mM，37℃继续培养3-4小时。(4)从所述经过诱导的宿主细胞分离和纯化所述胸膜肺炎放线杆菌免疫保护性抗原。所述的胸膜肺炎放线杆菌免疫保护性抗原能够与兔抗胸膜肺炎放线杆菌多克隆抗体进行结合反应，表明其具有很好的免疫反应性，可用于样品中胸膜肺炎放线杆菌抗体水平的测定。因此，上述胸膜肺炎放线杆菌免疫保护性抗原具有制备用于检测胸膜肺炎放线杆菌抗体的试剂盒的应用，所述试剂盒基于的方法包括ELISA法、蛋白印迹法、胶体金免疫法、斑点杂交法等。所述的胸膜肺炎放线杆菌免疫保护性抗原免疫小鼠后，能为小鼠感染胸膜肺炎放线杆菌提供有效的免疫保护力，表明其具有很好的免疫原性和免疫保护作用。因此，所述胸膜肺炎放线杆菌免疫保护性抗原具有制备猪胸膜肺炎亚单位疫苗的应用，具有制备用于预防由胸膜肺炎放线杆菌引起的疾病的药物的应用。相应的，上述编码所述免疫保护性抗原的核苷酸、表达所述免疫保护性抗原的重组表达载体或重组工程菌，也具有这些应用：制备用于检测胸膜肺炎放线杆菌抗体的试剂盒的应用，制备猪胸膜肺炎亚单位疫苗的应用，制备用于预防由胸膜肺炎放线杆菌引起的疾病的药物的应用。本专利技术具有如下优点和有益效果：本专利技术的免疫保护性抗原蛋白APJL_0922的免疫原性和免疫保护作用强，用其免疫小鼠后再以6×LD50剂量的胸膜肺炎放线杆菌感染小鼠，存活率达90％以上；经抗APJL_0922蛋白高免血清被动免疫的小鼠，以6×LD50剂量的胸膜肺炎放线杆菌感染小鼠，存活率达80％以上。本专利技术为制备猪胸膜肺炎亚单位疫苗提供了新的材料，对猪胸膜肺炎的防制具有重要意义。附图说明图1是表达载体pGEX-KG-APJL_0922的酶切鉴定图。泳道M：DL15000DNAmarker；泳道1：质粒pGEX-KG-APJL_0922BamHI/HindIII酶切。图2是工程菌表达目的蛋白APJL_0922的SDS-PAGE检测图。泳道M：预染的蛋白质marker；泳道1：大肠杆菌/pGEX-KG空载体全菌裂解液；泳道2：大肠杆菌/pGEX-KG-APJL_0922菌体裂解沉淀；泳道3：大肠杆菌/pGEX-KG-APJL_0922菌体裂解上清；泳道4：大肠杆菌/pGEX-KG-APJL_0922全菌裂解液。图3是免疫印迹分析目的蛋白的结果图。A图为APJL_0922纯化后的SDS-PAGE图，B图为转膜后免疫印迹图。泳道M：预染的蛋白质marker；泳道1：纯化的GST蛋白；泳道2：纯化的APJL_0922蛋白。箭头所示为APJL_0922蛋白免疫印迹显色条带。图4是APJL_0922蛋白的免疫保护力结果图。A图为APJL_0922免疫后攻毒小鼠存活率图，B图为抗APJL_0922多克隆抗体被动免疫小鼠攻毒后小鼠存活率图。感染后72h至观察期结束，小鼠存活率未发生变化。具体实施方式以下实施例用于进一步说明本专利技术，但不应理解为对本专利技术的限制。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例1APJL_0922蛋白的表达一、胸膜肺炎放线杆菌基因组DNA的提取取1mL过夜培养的胸膜肺炎放线杆菌(JL03)的菌液，12000rpm离心1分钟，弃去上清，然后按照基因组提取试剂盒(武汉博越生物技术有限公司)说明书提取JL03菌株的基因组。具体流程如下：在菌体沉淀中加入200μLRB重悬，10000rpm离心30秒，弃上清，再加入200μLRB重悬沉淀，然后，在离心管中加入20μL溶菌酶剧烈震荡，并放于37℃温箱中温育15分钟，之后再加入200μL结合液CB，颠倒混匀后加入20μL蛋白酶K(20mg/mL)，混匀，放于70℃水浴锅中反应10分钟，拿出冷却后加入100μL异丙醇，颠倒混匀，然后将离心管中的所有物质转入吸附柱中，10000rpm离心30秒，倒掉废液，再加入500μLIR，12000rpm离心30秒，弃废液，接着加入700μLWB，12000rpm离心30秒，弃掉废液，再加入500μLWB，12000rpm离心30秒，弃废液，然后13000rpm离心2分钟，取出吸附柱，放入新的离心管中，在吸附膜的中间部位加50μLEB，室温放置5分钟，12000rpm离心1分钟，所得溶液即基因组，放入-20℃储存备用。二、APJL_0922基因的制备根据APJL_0922基因的核苷酸序列(如序列表的SEQIDNO.2所示)，设计如下引物：正向引物：5’-TGGGATCCTGTAAAGAAGAGAAGAAAGC-3’，反向引物：5’-GGAAGCTTTTACCAACCTTTTATCACAC-3’。正向引物的下划线部分为BamHI酶切位点，反向引物的下划线部分为HindIII酶切位点。以胸膜肺炎放线杆菌JL03基因组DNA为模板，用设计的引物进行PCR扩增，获得APJL_0922成熟多肽编码序列。扩增体系如下：PC本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种胸膜肺炎放线杆菌免疫保护性抗原蛋白，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
【技术特征摘要】
1.一种胸膜肺炎放线杆菌免疫保护性抗原蛋白，其特征在于：其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。2.权利要求1所述的免疫保护性抗原蛋白的成熟多肽，其特征在于：为SEQIDNO.1所示序列的20-273位氨基酸。3.编码权利要求1所述的免疫保护性抗原蛋白的核苷酸，其特征在于：序列如SEQIDNO.2所示。4.一种重组表达载体，其特征在于：包含权利要求2所述的成熟多肽的编码序列。5.一种重组工程菌，其特征在于：为包含权利要求4所述的重组表达载体的大肠杆菌。6.一种胸膜肺炎放线杆菌免疫保护性抗原的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)构建包含权利要求1所述的免疫保护性抗原蛋白或其成熟多肽编码序列的重组表达载体；(2)将所述重组表达载体转化到宿主细胞中；(3)培养所述经转化的宿主细胞并诱导其表达所述免疫保护性抗原；(4)从所述经过诱导的宿主细胞分离和纯化，得到所述免疫保护性抗原蛋白或其成熟多肽。7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘金林，祁超，曹雨柔，高露露，张丽，
申请(专利权)人：华中师范大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42
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