一种大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞原代提取方法技术

本发明专利技术涉及生物细胞培养技术领域，具体涉及一种大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞原代提取方法，包含以下步骤：①绑定静脉输液针与气管、②快速注入消化液、③肺入离心管、④吸取消化液、⑤缓慢注入消化液、⑥消化液再利用、⑦循环操作。本发明专利技术循环利用初始添加的消化液，反复吸取并注入肺中进行消化，使注入肺中的消化液量基本等于渗出肺的消化液量，保证消化液始终充满肺泡，从而使得消化持续稳定且快速，使消化更充分，消化总时间大大缩短，有效的增加了消化液消化效率和利用率，避免了消化液的浪费，增加了Ⅱ型肺泡上皮细胞原代产量。

【技术实现步骤摘要】
一种大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞原代提取方法
本专利技术涉及生物细胞培养
，具体涉及一种大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞原代提取方法。
技术介绍
大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞分离自肺组织；Ⅱ型肺泡上皮细胞有分裂、增殖并分化为Ⅰ型肺泡细胞的潜能，故具有修复受损伤上皮的作用。目前培养大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞的方法主要为酶消化法，动物来源主要为目前生命科学研究领域最常见、最实用、最方便的实验动物--大鼠,现有技术中要提取大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞的方法为,首先将胰酶和Ⅰ型胶原酶混合液（即消化液）注入大鼠的肺中后，把肺置于离心管中，再把装有肺的离心管置于37℃水浴缸中水浴消化20-30分钟（以达到将肺泡上皮细胞从肺泡内消化剥离的目的），每隔5分钟补充一次消化液，最后把肺切碎,加入终止液终止消化后，进行后续提取与培养操作。但是申请人在实际操作中发现，传统培养方法中水浴消化过程耗时长，而且首次注入消化液后，消化液会不断渗出肺外，也就不能保证所有肺泡内都始终存在消化液，导致肺泡内的上皮细胞未得到充分消化，降低消化效果与消化效率；为了使肺泡内的上皮细胞充分消化，传统方法中每隔5分钟中就会向肺中补充一次消化液，该方法无形中又增加了消化液用量，而且补充消化液是快速补充，从补充完到下一次补充这段时间，消化液依然会不断渗出肺外，肺泡内的上皮细胞依然未得到持续性的充分消化；另外，由于不断补充消化液，使得水浴消化结束后，依然还有很大部分消化液未被利用，造成消化液的浪费，消化液利用率非常低。
技术实现思路
针对上述问题，本专利技术的目的在于提供一种耗时短，消化速度快，消化液利用率高，Ⅱ型肺泡上皮细胞原代产量高的大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞原代提取方法。一种大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞原代提取方法，它包含以下步骤：①绑定静脉输液针与气管：将支气管及其上连接的两肺从大鼠体内解剖下来，冲洗残余血液，去除坏死的组织，置于大培养皿中，将静脉输液针针尖处1cm用镊子弄断，保留1-1.5cm的针头（防止尖锐的针尖刺破气管），将静脉输液针针头插入肺的气管中，用止血钳将气管与针头固定，再用黑线绑定好静脉输液针和气管（上下各系3匝）；②快速注入消化液：将15ml0.25%胰酶和15ml0.1%Ⅰ型胶原酶倒入50ml离心管中混合均匀得消化液，用注射器将上述消化液抽出20ml后，将注射器与静脉输液针的导管相连，推压注射器，通过静脉输液针将消化液快速打入肺中，使两侧肺迅速充盈，判断肺有无漏液现象；若无漏液现象，则继续将50ml离心管中余下的10ml消化液倒入大培养皿中；③肺入离心管：右手提起输液针连接的肺组织放置于50ml离心管中,再把离心管放在管架上；④吸取消化液：将注射器与静脉输液针的导管脱开，左手食指、中指夹住导管（注意导管头端不要污染），左手其他手指辅助将大培养皿倾斜，同时右手持注射器将大培养皿中的消化液吸取（注意保留一小部分消化液防止在大培养皿中消化下来的细胞干死，有助于将残留在导管中的消化液完全推入肺中）；⑤缓慢注入消化液：将导管和注射器重新连接（注射器要保留一部分空气，以便最后推走导管内的消化液），左手持离心管，将装有肺的离心管置于35-38℃的水浴锅中，右手持注射器缓慢推消化液，速度控制在3-4min将消化液推完；⑥消化液再利用：推完消化液后，左手把离心管由水浴锅中拿出，右手用静脉输液针将肺提出离心管，之后左手将离心管中从肺泡中渗出的消化液倒入大培养皿中；⑦循环操作：重复步骤③至⑥的操作2-4次；消化总时间控制在12-17min，之后加终止液，停止消化过程。进一步地，步骤⑥中水浴锅内的温度为37℃。进一步地，步骤⑧中消化总时间控制在15min。本专利技术循环利用初始添加的消化液，反复吸取并注入肺中进行消化，使注入肺中的消化液量基本等于渗出肺的消化液量，保证消化液始终充满肺泡，从而使得消化持续稳定且快速，使消化更充分，消化总时间大大缩短，有效的增加了消化液消化效率和利用率，避免了消化液的浪费，增加了Ⅱ型肺泡上皮细胞原代产量。附图说明图1为本专利技术一种大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞原代提取方法中静脉输液针和气管连接固定时的示意图；图2为本专利技术一种大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞原代提取方法中注射器吸取消化液后连接导管时的示意图；图3为本专利技术一种大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞原代提取方法中将装有肺的离心管中置于水浴锅中并缓慢注入消化液进行消化示意图。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术的原理和特征做进一步详细描述，所举实例只用于解释专利技术，并非用于限定本专利技术的范围。实施例一：需要器材：健康大鼠、大培养皿、静脉输液针、导管（静脉输液针自带）、黑线、15ml胰酶、15mlⅠ型胶原酶、注射器、离心管。操作步骤：①绑定静脉输液针与气管：将支气管及其上连接的两肺从大鼠体内解剖下来，冲洗残余血液，去除坏死的组织，置于大培养皿中，将静脉输液针针尖处1cm用镊子弄断，保留1cm的针头（防止尖锐的针尖刺破气管），将静脉输液针针头插入肺的气管中，用止血钳将气管与针头固定，再用黑线绑定好静脉输液针和气管（上下各系3匝）（如图1所示）；②快速注入消化液：将15ml0.25%胰酶和15ml0.1%Ⅰ型胶原酶倒入50ml离心管中混合均匀得消化液，用注射器将上述消化液抽出20ml后，将注射器与静脉输液针的导管相连，推压注射器，通过静脉输液针将消化液快速打入肺中，使两侧肺迅速充盈，判断肺有无漏液现象；若无漏液现象，则继续将50ml离心管中余下的10ml消化液倒入大培养皿中；其中注射器选用20ml注射器；③肺入离心管：右手提起输液针连接的肺组织放置于50ml离心管中,再把离心管放在管架上；④吸取消化液：将注射器与静脉输液针的导管脱开，左手食指、中指夹住导管（注意导管头端不要污染），左手其他手指辅助将大培养皿倾斜，同时右手持注射器将大培养皿中的消化液吸取（注意保留一小部分消化液防止在大培养皿中消化下来的细胞干死，有助于将残留在导管中的消化液完全推入肺中）；⑤缓慢注入消化液：将导管和注射器重新连接（注射器要保留一部分空气，以便最后推走导管内的消化液），左手持离心管，将装有肺的离心管置于37℃的水浴锅中，右手持注射器缓慢推消化液，速度控制在4min将消化液推完（如图2、图3所示）；⑥消化液再利用：推完消化液后，左手把离心管由水浴锅中拿出，右手用静脉输液针将肺提出离心管，之后左手将离心管中从肺泡中渗出的消化液倒入大培养皿中；⑦循环操作：重复步骤③至⑥的操作3次，两次重复步骤⑤的间隔时间尽量要短，该间隔时间内渗出量越少越好；消化总时间控制在15min，之后加终止液，停止消化过程。实施例二：需要器材：健康大鼠、大培养皿、静脉输液针、导管（静脉输液针自带）、黑线、15ml胰酶、15mlⅠ型胶原酶、注射器、离心管。操作步骤：①绑定静脉输液针与气管：将支气管及其上连接的两肺从大鼠体内解剖下来，冲洗残余血液，去除坏死的组织，置于大培养皿中，将静脉输液针针尖处1cm用镊子弄断，保留1.2cm的针头（防止尖锐的针尖刺破气管），将静脉输液针针头插入肺的气管中，用止血钳将气管与针头固定，再用黑线绑定好静脉输液针和气管（上下各系3匝）（如图1所示）；②快速注入消化液：将15ml0.25%胰酶和15ml0.1%Ⅰ型胶原酶倒入50ml离心管中混合均匀得消化液，用注射器将上述消化液抽出20ml后，将注本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞原代提取方法，其特征在于，它包含以下步骤：①绑定静脉输液针与气管：将支气管及其上连接的两肺从大鼠体内解剖下来，冲洗残余血液，去除坏死的组织，置于大培养皿中，将静脉输液针针尖处1cm用镊子弄断，保留1‑1.5cm的针头，将静脉输液针针头插入肺的气管中，用止血钳将气管与针头固定，再用黑线绑定好静脉输液针和气管；②快速注入消化液：将15ml0.25%胰酶和15ml0.1%Ⅰ型胶原酶倒入50ml离心管中混合均匀得消化液，用注射器将上述消化液抽出20ml后，将注射器与静脉输液针的导管相连，推压注射器，通过静脉输液针将消化液快速打入肺中，使两侧肺迅速充盈，判断肺有无漏液现象；若无漏液现象，则继续将50ml离心管中余下的10ml消化液倒入大培养皿中；③肺入离心管：右手提起静脉输液针连接的肺组织放置于50ml离心管中,再把离心管放在管架上；④吸取消化液：将注射器与静脉输液针的导管脱开，左手食指、中指夹住导管，左手其他手指辅助将大培养皿倾斜，同时右手持注射器将大培养皿中的消化液吸取，大培养皿留大约2ml消化液以防细胞干死，注意最后注射器抽入少许空气，有助于将残留在导管中的消化液完全推入肺中；⑤缓慢注入消化液：将导管和注射器重新连接，左手持离心管，将装有肺的离心管置于35‑38℃的水浴锅中，右手持注射器缓慢推消化液，速度控制在3‑4min将消化液推完；⑥消化液再利用：推完消化液后，左手把离心管由水浴锅中拿出，右手用静脉输液针将肺提出离心管，之后左手将离心管中从肺泡中渗出的消化液倒入大培养皿中；⑦循环操作：重复步骤③至⑥的操作2‑4次；消化总时间控制在12‑17min，之后加终止液，停止消化过程。...

【技术特征摘要】
1.一种大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞原代提取方法，其特征在于，它包含以下步骤：①绑定静脉输液针与气管：将支气管及其上连接的两肺从大鼠体内解剖下来，冲洗残余血液，去除坏死的组织，置于大培养皿中，将静脉输液针针尖处1cm用镊子弄断，保留1-1.5cm的针头，将静脉输液针针头插入肺的气管中，用止血钳将气管与针头固定，再用黑线绑定好静脉输液针和气管；②快速注入消化液：将15ml0.25%胰酶和15ml0.1%Ⅰ型胶原酶倒入50ml离心管中混合均匀得消化液，用注射器将上述消化液抽出20ml后，将注射器与静脉输液针的导管相连，推压注射器，通过静脉输液针将消化液快速打入肺中，使两侧肺迅速充盈，判断肺有无漏液现象；若无漏液现象，则继续将50ml离心管中余下的10ml消化液倒入大培养皿中；③肺入离心管：右手提起静脉输液针连接的肺组织放置于50ml离心管中,再把离心管放在管架上；④吸取消化液：将注射器与静脉输液针的导管脱开，左手食...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈博文，陈淼，蒲清湖，王洪亮，刘国跃，
申请(专利权)人：遵义医学院附属医院，
类型：发明
国别省市：贵州,52