一种制备A、B、E、F型四价肉毒抗毒素的方法技术

本发明专利技术公开了一种制备A、B、E、F型四价肉毒抗毒素的方法。本发明专利技术方法包括：以四种免疫原(A、B、E和F型肉毒毒素重组Hc蛋白)分别免疫动物，制备得到四种单价肉毒抗毒素；将所述四种单价肉毒抗毒素混合后制备得到A、B、E、F型四价肉毒抗毒素。本发明专利技术建立了肉毒毒素各型重组Hc免疫原免疫马以制备肉毒毒素治疗性中和抗体的新技术方案和中试工艺，通过精制工艺制备了高纯度、高效价的四价肉毒抗毒素。解决了不用类毒素作为免疫原制备马抗肉毒毒素治疗性抗体这个关键问题，提高了抗毒素的中和效价和产品的质量。本发明专利技术所制备的四价肉毒抗毒素可全面治疗各型肉毒素中毒。

【技术实现步骤摘要】
一种制备A、B、E、F型四价肉毒抗毒素的方法
本专利技术属于生物制药领域，涉及一种制备A、B、E、F型四价肉毒抗毒素的方法。
技术介绍
肉毒毒素是肉毒梭菌产生的外毒素，是目前已知最毒的蛋白质，分为七种血清型(A-G)，其中自然存在的A、B、E和F型毒素能够造成人类中毒，C、D型则常引起动物、禽类中毒，G型引起人类中毒的报道较少。肉毒毒素中毒在人群中发病机率小，但其毒性大，致死率高，对公共卫生安全危害极大，必须引起人们的高度重视。从灵长类动物试验结果推定体重为70千克人肉毒毒素中毒的半致死剂量静脉或肌肉注射时为0.09-0.15μg，吸入时为0.7-0.9μg，口服时为70μg。人类肉毒中毒有5种类型：1)食物性肉毒中毒，这类肉毒中毒一般是食物加工过程中被肉毒梭菌的芽胞污染，在厌氧的条件下细菌繁殖并产生毒素，人们食用了被毒素污染的食物而引起食物中毒，往往是集体中毒，病情凶险，属公共卫生突发事件，在世界各国时有发生，如2006年3月14日在泰国暴发了163人集体A型肉毒中毒的疫情；2)婴儿肉毒中毒，由于新生儿正常肠道菌群缺乏，其食入的肉毒梭菌芽孢可以萌发、繁殖、产生毒素，从而引起婴儿中毒；3)除了常见食物性和婴儿肉毒中毒，肉毒毒素吸入性中毒也是可能发生的，如在实验室中曾发生过肉毒毒素吸入性中毒，这是一种潜在的借助空气传播中毒方式，并且它们极有可能通过空气传播肉毒毒素被恐怖主义分子利用或用于生物战剂。4)创伤性肉毒中毒，类似于破伤风，由于伤口处污染的肉毒梭菌芽孢繁殖、产毒，毒素从伤口进入血液循环而导致，比较少见。5)成人感染型肉毒中毒(Adultinfectiousbotulinum)，在特殊的情况下，肉毒梭菌也能在成人的肠道中定居，繁殖产毒，经肠道吸收后引起中毒症状，这类肉毒中毒的病人一般都有胃肠道手术史，或者近期应用抗生素治疗破坏了胃肠道正常菌群。由于产生肉毒毒素的肉毒梭菌在自然界广泛存在，并且其芽孢对外界环境具有较强的抵抗力，肉毒毒素中毒仍然是一个十分严重的公共卫生问题。疫苗和中和抗体药物是目前防治肉毒素毒素中毒唯一有效的预防和治疗药物。理论上，针对肉毒毒素作用过程中的任何一个或几个环节进行阻断，均可抑制肉毒毒素的毒性。然后，目前阻断肉毒重链进入神经细胞的小分子抑制剂的抑制活性很难达到抗毒素水平，因此中和抗体仍然是预防和治疗肉毒毒素中毒的最有效的药物分子，其作用机制是抗体结合肉毒毒素阻断毒素分子进入神经细胞，或结合/中和毒素分子中和毒性。疫苗可用于肉毒毒素中毒的预防，而对已发生的肉毒毒素中毒则只能应用中和抗体进行特异性治疗。到目前为止，抗毒素是治疗肉毒毒素中毒唯一有效的特效药。虽然动物源性免疫球蛋白在人用时仍然存在导致血清病等副作用，但在人源抗血清无法满足规模化制备需求，而基因工程单克隆抗体仍未有上市产品的情况下，它仍是目前的最佳选择。并且随着制备技术的进步，抗毒素效价的增强和F(ab')2纯度的提高，相应的副作用已得到大大降低。美国已批准二价(抗A和B型毒素)、三价(抗A、B和E型毒素)马源抗毒素和其他马抗毒素(如单价E型、七价肉毒抗毒素)，可用于治疗肉毒中毒。另外，由于人源抗血清无法满足规模化制备的需求，五价人源抗毒素(BIG-IV)被批准专门应用于治疗婴儿肉毒中毒。我国兰州生物制品研究所研制的A、B、C、D、E、F6个血清型的单价抗毒素也均已通过SFDA认证上市。国际上和国内肉毒毒素抗毒素均是采用全长类毒素免疫动物而制备的。类毒素的一些表位，尤其对抗体识别与中和作用至关重要的表位可能在毒素灭活过程中发生改变，无论是作为免疫原或是抗原，类毒素与毒素之间都存在一定的差异。同时，类毒素本身还存在过多的非中和表位，导致免疫产生的抗体虽然滴度可以很高，但有效成分中和抗体的比例较低，即比活性相对较低，抗毒素的中和活性受到影响，而衡量抗毒素药效的最重要指标为中和抗体的活性(比活性)。因此，一个理想的免疫原应该是保持其自身结构的最小的非毒性部分，能产生完全的免疫保护，同时缺乏整个毒素的生物学特性。肉毒毒素保护性抗原为重链受体结合区(Hc)，它包含保护性抗原基本决定簇，在动物体内能够诱发高水平的中和抗体，对于极高剂量的毒素的攻击具有完全的保护效果。以Hc为免疫原制备肉毒毒素抗毒素将具有更大的优势，不仅可以产生高滴度的中和抗体，而且可以减少非中和抗体的产生。
技术实现思路
本专利技术的一个目的在于公开一种制备四价肉毒抗毒素制剂的新方法，在本专利技术的制备条件下，该制剂分别含有A、B、E、F各型肉毒抗毒素免疫球蛋白F(ab′)2抗体原液，而获得的用于治疗各型肉毒抗毒素免疫球蛋白F(ab′)2抗体的免疫原是肉毒毒素重组Hc蛋白。本专利技术的另一个目的在于公开制备用于治疗A、B、E、F型肉毒毒素中毒的四价肉毒抗毒素样品，能对四种肉毒毒素同时起到治疗作用。第一方面，本专利技术要求保护一种制备A、B、E、F型四价肉毒抗毒素的方法。本专利技术所提供的制备A、B、E、F型四价肉毒抗毒素的方法，可包括如下步骤：(a)以四种免疫原分别免疫动物，制备得到四种单价肉毒抗毒素；所述四种免疫原分别为A型肉毒毒素重组Hc蛋白、B型肉毒毒素重组Hc蛋白、E型肉毒毒素重组Hc蛋白和F型肉毒毒素重组Hc蛋白；相应的，所述四种单价肉毒抗毒素分别为A型肉毒抗毒素、B型肉毒抗毒素、E型肉毒抗毒素和F型肉毒抗毒素；(b)将所述四种单价肉毒抗毒素按照一定比例混合后制备得到A、B、E、F型四价肉毒抗毒素。其中，步骤(b)中，将所述四种单价肉毒抗毒素按照一定比例混合后需满足如下条件：使最终所得的所述四价肉毒抗毒素对A型肉毒毒素的中和效价不低于10000IU/支或瓶(每瓶或每支规格可为10mL)，对B型肉毒毒素、E型肉毒毒素和F型肉毒毒素的中和效价不低于5000IU/支或瓶(每瓶或每支规格可为10mL)。进一步地，步骤(a)中，在对所述动物进行免疫后还可包括如下步骤：取所述动物的免疫血浆，然后用胃蛋白酶进行消化处理(切除具有副作用的免疫球蛋白的Fc段)，得到分别抗A、B、E、F型四种肉毒毒素的四种免疫球蛋白F(ab′)2抗体原液，即为所述四种单价肉毒抗毒素。其中，所述用蛋白酶进行消化处理的条件具体可为：pH3.0-3.6，29-31℃，30-40分钟。另外，在用胃蛋白酶进行消化处理后，还可包括用硫酸铵盐析、明矾沉淀、超滤、凝胶层析、除菌等工艺步骤。进一步地，所述用硫酸铵盐析可按照包括如下步骤的方法进行：加入终浓度为150g/L硫酸铵，调pH5.2-5.6，加温至57-58℃，维持温度30分钟；降温至45℃以下，加硅藻土(终浓度为5-10g/L)，板框压滤，收集滤液，弃沉淀；滤液调pH7.0-7.4，加终浓度为200g/L硫酸铵，静置60分钟；加硅藻土(终浓度为5-10g/L)，板框压滤，收集沉淀。所述明矾沉淀可按照包括如下步骤的方法进行：35℃以下，加水溶解沉淀，加10％(体积百分含量)明矾液(明矾终浓度为8g/L)调pH7.8-7.9，静置90分钟，板框压滤，弃沉淀。所述超滤可按照包括如下步骤的方法进行：以水补液进行超滤脱铵，调pH6-7。所述凝胶层析为将经所述超滤获得的超滤浓缩液过DEAE凝胶层析柱纯化。所述除菌可按照包括如下步骤的方法进行：添加氯化钠、间甲酚，调pH6-7本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种制备A、B、E、F型四价肉毒抗毒素的方法，包括如下步骤：(a)以四种免疫原分别免疫动物，制备得到四种单价肉毒抗毒素；所述四种免疫原分别为A型肉毒毒素重组Hc蛋白、B型肉毒毒素重组Hc蛋白、E型肉毒毒素重组Hc蛋白和F型肉毒毒素重组Hc蛋白；所述四种单价肉毒抗毒素分别为A型肉毒抗毒素、B型肉毒抗毒素、E型肉毒抗毒素和F型肉毒抗毒素；(b)将所述四种单价肉毒抗毒素混合后制备得到A、B、E、F型四价肉毒抗毒素。

【技术特征摘要】
1.一种制备A、B、E、F型四价肉毒抗毒素的方法，包括如下步骤：(a)以四种免疫原分别免疫动物，制备得到四种单价肉毒抗毒素；所述四种免疫原分别为A型肉毒毒素重组Hc蛋白、B型肉毒毒素重组Hc蛋白、E型肉毒毒素重组Hc蛋白和F型肉毒毒素重组Hc蛋白；所述四种单价肉毒抗毒素分别为A型肉毒抗毒素、B型肉毒抗毒素、E型肉毒抗毒素和F型肉毒抗毒素；(b)将所述四种单价肉毒抗毒素混合后制备得到A、B、E、F型四价肉毒抗毒素。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(a)中，在对所述动物进行免疫后还包括如下步骤：取所述动物的免疫血浆，然后用胃蛋白酶进行消化处理，得到分别抗A、B、E、F型四种肉毒毒素的四种免疫球蛋白F(ab′)2抗体原液，即为所述四种单价肉毒抗毒素。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述动物为马。4.根据权利要求3中任一所述的方法，其特征在于：步骤(a)中，对所述动物进行免疫为多次免疫，初免时免疫原用量为2mg每匹马，之后的加强免疫逐渐增加免疫原用量。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：进行所述初免时采用弗氏完全佐剂，进行所述加强免疫时采用弗氏不完全佐剂。6.根据权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：余云舟，师丹阳，杨志新，陆建昇，王荣，周晓巍，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事科学院军事医学研究院，
类型：发明
国别省市：北京,11