甲鱼小分子多肽制造技术

本发明专利技术公开了甲鱼小分子多肽及其制备方法，包括：预处理、发酵、酶解、分离，首先将甲鱼预处理并脱脂后配得发酵基质，然后接种入米曲霉与酿酒酵母，加入发酵增效剂进行发酵培养，在发酵液中加入中性蛋白酶进行酶解，将酶解液超滤后经柱层析，分管收集洗脱峰干燥即得甲鱼小分子多肽。有益效果为：甲鱼小分子多肽具有较强的抑瘤作用，可以作为增强剂配合抑瘤制剂使用，其制备工艺简洁，甲鱼蛋白的发酵与酶解效率较高，可以节省大量的能量与时间成本。

【技术实现步骤摘要】
甲鱼小分子多肽
本专利技术涉及甲鱼的深加工领域，尤其是涉及甲鱼小分子多肽。技术背景甲鱼（AmydaSincnsis），是鳖的俗称，也叫团鱼、水鱼、是卵生两栖爬行动物，是龟鳖目鳖科软壳水生龟的统称。共有20多种。中国现存主要有中华鳖、山瑞鳖、斑鳖、鼋，其中以中华鳖最为常见。甲鱼不仅是餐桌上的美味佳肴，上等筵席的优质材料，还可作为中药材料入药。其具有诸多滋补药用功效，有清热养阴，平肝熄风，软坚散结，对肝硬化，肝脾肿大，小儿惊痫等作用。甲鱼富含动物胶、角蛋白、铜、维生素D等营养素，能够增强身体的抗病能力及调节人体的内分泌功能，也是提高母乳质量、增强婴儿的免疫力及智力的滋补佳品。甲鱼的腹板称为“龟板”，是名贵的中药，有滋阴降火之功效。用于治疗头晕、目眩、虚热、盗汗等疾患。还对头颅外伤(例如新生儿头颅血肿等)遗留下来的顽固性头痛有很好的疗效。龟板胶是大分子胶原蛋白质，含有皮肤所需要的各种氨基酸，有养颜护肤、美容健身之效。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供甲鱼小分子多肽，甲鱼小分子多肽具有较强的抑瘤作用，可以作为增强剂配合抑瘤剂使用，制备工艺简洁，甲鱼蛋白的发酵与酶解效率较高，可以节省大量的能量与时间成本，甲鱼小分子多肽分成四段分子量区间，既避免了发酵液中活性多肽的浪费，还有利于对其精细化、区别化地进一步研究。本专利技术方法中所使用的微生物及其所购买企业为：米曲霉，保定微农生物科技有限公司；酿酒酵母菌，烟台曼森商贸有限公司。本专利技术针对
技术介绍
中提到的问题，采取的技术方案为：甲鱼小分子多肽，其制备方法包括：预处理、发酵、酶解、分离，具体包括以下步骤：预处理：取新鲜的甲鱼，清洗干净后低温处死，去壳去内脏取甲鱼肉置于高速匀浆机匀浆，按照肉液比1:5～7的比例与异丙醇混合均匀，在25～28℃温度下反应3～5h，过滤，在4500～5000r/min转速下离心20～30min，晾干粉碎即得脱脂粉，以蒸馏水稀释脱脂粉至质量分数为25～33%，调节pH值至6.8～7.0，在121～122℃温度下灭菌12～15min即得发酵基质；经脱脂处理后，甲鱼蛋白的含量增高，无用的脂肪等杂质被清除，既提高了发酵效率，又避免了脂肪对发酵菌的影响；发酵：取发酵基质干重3.5～4.0%的米曲霉种子液、2.0～3.0%的酿酒酵母菌种子液接种入发酵基质中，另外再加入种子液重量0.3～1.0%的发酵增效剂，在120～160r/min转速、28～30℃温度条件下发酵培养48～60h；发酵结束后，将发酵液煮沸8～10min灭酶，11000～12000r/min离心15～30min，上清液过0.2～0.25μｍ微孔滤膜，滤液即为发酵液；在此发酵条件下，甲鱼蛋白回收率可达85%以上，蛋白质被酶解为蛋白质片段，变成了易于吸收、溶解性好、乳化性好、具有多种生理活性的发酵液，改善了蛋白质的功能特性，提高了蛋白质的营养及利用价值；利用混合菌发酵可以发挥多种菌种间的协同作用，降低单菌发酵的劣势，菌种间可能产生共生作用，代谢产物发生互补效应，能够克服中间产物过多对抗菌肽生成的不利因素，制备活性多肽的成本更低，发酵反应较温和，发酵过程易控；酶解：将发酵液低温调整至含水量为70～75%，添加2500～3300U/g中性蛋白酶，再加入中性蛋白酶重量3.5～4.6‰的（R）-1,1’-联萘-2,2’-酚基二异丙氧钛，微波辅助酶解，微波功率为260～300W，间歇微波时间为5～8min，在酶解温度为53～55℃、酶解pH值为7.3～7.5的条件下酶解1.5～2.0h，酶解结束后煮沸12～15min灭酶得酶解液；（R）-1,1’-联萘-2,2’-酚基二异丙氧钛能够作用于中性蛋白酶的金属原子活性中心，降低蛋白酶与底物之间的能量壁垒，增大酶与底物之间的反应活性，从而大大提高蛋白酶的酶解活性，加速酶解，使甲鱼蛋白的水解度可达到34％以上，提高了甲鱼多肽的产量与产率，同时节省了能量与时间成本，具有较高的推广价值；分离：在0.25～0.28MPa压力下，将酶解液依次用透过分子质量为5KDa、3KDa与1KDa的超滤膜超滤，得到四段不同分子量区间的甲鱼小分子多肽：T1（>5KDa）、T2（5KDa～3KDa）、T3（3KDa～1KDa）与T4（<1KDa），经柱层析分离后取洗脱峰分管收集并干燥即得甲鱼小分子多肽；将甲鱼小分子多肽分成四段不同分子量区间，不仅避免了发酵液中活性多肽的浪费，还可以更加精细化、区别化地进一步研究各个分子量区间段多肽的生物学活性；甲鱼小分子多肽对某些肿瘤细胞DNA的合成有明显的抑制作用，主要通过影响肺癌细胞线粒体空泡化，从而使增殖的肿瘤细胞因能量供给缺乏而受到增殖限制，从而达到抑瘤作用，且随剂量的增长作用增强，是一种可配合抑瘤制剂使用的增强剂。作为优选，发酵增效剂包含下列含量的物质：65～80%尿素、2～6%α-萘乙酸钠、15～20%氧化钙、3～7%硫酸镁、1～5%磷酸二甲酯；尿素可以均质化甲鱼匀浆，使甲鱼匀浆组织更好的与微生物代谢出的酶接触，增大二者的接触几率，提高发酵效率；同时，发酵增效剂中特殊配比的α-萘乙酸钠与磷酸二甲酯具有协同作用，该协同作用可以促使酿酒酵母菌增强对乙酰辅酶A的分泌，进而增进其与草酰乙酸的缩合反应，加快柠檬酸的合成，可以大幅度提高酿酒酵母菌三羧酸循环的速度，加快酿酒酵母菌的生长繁殖与发酵代谢，促使酿酒酵母菌代谢出更多的酶与发酵底物作用，进而提高小分子多肽的产率与产量。作为优选，柱层析操作为：选用SephadexG-25柱层析，用蒸馏水平衡后装柱（16mm×500mm），上样质量浓度2～3mg/mL，上样量2mL，洗脱液为蒸馏水，流速20～25mL/h，在220nm处检测，收集洗脱峰；柱层析可以较为迅速、精确的得到目标波长的洗脱峰组分，同时又不会影响甲鱼小分子多肽的结构与性质。与现有技术相比，本专利技术的优点在于：1）经脱脂处理后，甲鱼蛋白的含量增高，无用的脂肪等杂质被清除，既提高了发酵效率，又避免了脂肪对发酵菌的影响；2)利用混合菌发酵可以发挥多种菌种间的协同作用，可以降低单菌发酵的劣势，菌种间可能产生共生作用，代谢产物发生互补效应，能够克服中间产物过多对抗菌肽生成的不利因素，提高发酵效率，节约能量成本与时间成本；3）酶解时加入的（R）-1,1’-联萘-2,2’-酚基二异丙氧钛能够作用于蛋白酶的金属原子活性中心，降低与底物之间的能量壁垒，增大反应活性，大大提高蛋白酶的酶解活性，加速酶解，使甲鱼蛋白的水解度可达到34％以上，提高了甲鱼多肽的产量与产率，同时节省了能量与时间成本；4）发酵增效剂中特殊配比的α-萘乙酸钠与磷酸二甲酯具有协同作用，该协同作用可以促使酿酒酵母菌增强对乙酰辅酶A的分泌，加快其与草酰乙酸缩合合成柠檬酸的速度，大幅度提高酿酒酵母菌三羧酸循环的速度，加快酿酒酵母菌的生长繁殖与发酵代谢，促使酿酒酵母菌代谢出更多的酶，提高小分子多肽的产率与产量；5）甲鱼小分子多肽对某些肿瘤细胞DNA的合成有明显的抑制作用，主要通过影响肺癌细胞线粒体空泡化，从而使增殖的肿瘤细胞因能量供给缺乏而受到增殖限制，从而达到抑瘤作用，且随剂量的增长作用增强，是一种可配合抑瘤制剂使用的增强剂。具体实施方式下面通过实施例对本专利技术方案作进一本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.甲鱼小分子多肽，其特征在于：所述甲鱼小分子多肽的制备方法包括：预处理：取新鲜的甲鱼，清洗干净后低温处死，去壳去内脏取甲鱼肉置于高速匀浆机匀浆，经脱脂操作后得到脱脂粉，以蒸馏水稀释脱脂粉至质量分数为25～33%，调节pH值至6.8～7.0，灭菌即得发酵基质；发酵：取发酵基质干重3.5～4.0%的米曲霉、2.0～3.0%的酿酒酵母菌接种，加入种子液重量0.3～1.0%的发酵增效剂发酵；灭酶后离心，取上清液过0.2～0.25μｍ微孔滤膜，滤液即为发酵液；酶解：将发酵液低温调整至含水量为70～75%，添加2500～3300U/g中性蛋白酶，再加入(R)‑1,1’‑联萘‑2,2’‑酚基二异丙氧钛，微波辅助酶解，酶解结束后灭酶得酶解液；分离：在0.25～0.28MPa压力下，将酶解液依次用透过分子质量为5KDa、3KDa与1KDa的超滤膜超滤，得到四段不同分子量区间的多肽，经柱层析分离后取洗脱峰分管收集并干燥即得甲鱼小分子多肽。

【技术特征摘要】
1.甲鱼小分子多肽，其特征在于：所述甲鱼小分子多肽的制备方法包括：预处理：取新鲜的甲鱼，清洗干净后低温处死，去壳去内脏取甲鱼肉置于高速匀浆机匀浆，经脱脂操作后得到脱脂粉，以蒸馏水稀释脱脂粉至质量分数为25～33%，调节pH值至6.8～7.0，灭菌即得发酵基质；发酵：取发酵基质干重3.5～4.0%的米曲霉、2.0～3.0%的酿酒酵母菌接种，加入种子液重量0.3～1.0%的发酵增效剂发酵；灭酶后离心，取上清液过0.2～0.25μｍ微孔滤膜，滤液即为发酵液；酶解：将发酵液低温调整至含水量为70～75%，添加2500～3300U/g中性蛋白酶，再加入(R)-1,1’-联萘-2,2’-酚基二异丙氧钛，微波辅助酶解，酶解结束后灭酶得酶解液；分离：在0.25～0.28MPa压力下，将酶解液依次用透过分子质量为5KDa、3KDa与1KDa的超滤膜超滤，得到四段不同分子量区间的多肽，经柱层析分离后取洗脱峰分管收集并干燥即得甲鱼小分子多肽。2.根据权利要求1所述的甲鱼小分子多肽，其特征在于：所述预处理步骤中的脱脂操作为：将甲鱼匀浆按照肉液比1:5～7的比例与异丙醇混合均匀，在25～28℃温度下反应3～5h，过滤、离心、晾干粉碎即得脱脂粉。3...

【专利技术属性】
技术研发人员：汪珂，
申请(专利权)人：金华市景和科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33