肝移植中HLA-C1/C2基因PCR-SSP快速鉴定方法技术

本发明专利技术基于HLA‑C1/C2基因的序列特征和HLA‑C基因组全长序列的单核苷酸多态性(SNPs)，采用HLA‑C位点特异性PCR引物和HLA‑C1/C2组特异性引物扩增策略，即设计一条共用的HLA‑C基因特异性PCR扩增引物，分别与一条针对HLA‑C1的组特异性PCR引物、一条针对HLA‑C2的组特异性PCR引物进行配组，仅用2个PCR反应分别扩增HLA‑C1、C2基因；由于所用引物具有相近的退火温度，可在同一PCR扩增条件下进行同步扩增；扩增产物经琼脂糖电泳检测，可清晰直观地判定受检者的HLA‑C1/C2基因型，无需大型贵重设备、无需对当前国际上IMGT/HLA数据库已公布的3800余种HLA‑C等位基因进行基因分型；具有实验操作简单、所需时间短、成本低，适合于肝移植前对肝供体进行快速检测，以减少急性排斥、提高移植效果。

【技术实现步骤摘要】
肝移植中HLA-C1/C2基因PCR-SSP快速鉴定方法
本专利技术涉及生物医学，特别是涉及一种临床肝移植急性排斥相关的人类白细胞抗原HLA-C1/C2的PCR-SSP快速鉴定方法。
技术介绍
人类白细胞抗原(HLA)为人类主要组织相容性系统，承担重要的免疫识别、免疫应答和免疫调节的功能，与骨髓和实体器官移植的排斥反应密切相关。HLA-C分子为经典的HLAI类分子，不仅递呈内源性抗原肽给CD8+T细胞识别，介导特异性T细胞的免疫应答反应；而且作为杀伤细胞免疫球蛋白样受体(Killerimmunoglobulin-likereceptor,KIR)的配体，调节自然杀伤细胞的活性[1]，在移植免疫、肿瘤免疫和机体抗感染中发挥了重要作用。HLA-C分子由一条具有多态性的α多肽链(45kDa)和一条由位于15号染色体基因编码、没有多态性的β2微球蛋白(12kDa)通过非共价键组成异二聚体。编码α链的HLA-C基因共包括8个外显子及7个内含子；其中第1外显子编码引导肽，第2、第3、第4外显子分别编码α1、α2、α3区，第5外显子编码跨膜区，第6～8外显子编码胞浆尾。HLA-C分子为KIR受体的重要配体，根据IPD-KIR数据库(https://www.ebi.ac.uk/ipd/kir/ligand.html)和HLA-C分子第80位氨基酸残基的差异[2-3]，HLA-C分子可分为HLA-C1组(α1螺旋区第80位氨基酸残基为天冬氨酸)和HLA-C2组(α1螺旋区第80位氨基酸残基为赖氨酸)。所有的HLA-C分子均为KIR的配体，HLA-C1分子特异性识别KIR2DL2、KIR2DL3、KIR2DS2，而HLA-C2特异性识别KIR2DL1及KIR2DS1。近年来有研究表明HLA-C基因匹配程度对无关供者造血干细胞(骨髓)移植的效果具有显著影响[4-5]，因此HLA-C位点被列入了骨髓库HLA入库数据、临床供-受者骨髓移植HLA配型的常规检测项目。但是肝移植中受肝供体来源短缺等诸多因素影响，难以做到肝移植供-受者HLA完全匹配，通常肝移植前也不进行HLA配型检测，而肝移植急性排斥仍然是肝移植后面临的重要问题。当前，在HLA-KIR基因多态性与肝移植急性排斥的回顾性研究结果表明：HLA-C1/C2及其基因型与急性排斥相关，如Lee等[6]采用PCR-SSO方法对韩国肝移植供者进行HLA-C基因的基因分型，发现供者携带HLA-C2基因时，受者的急性排斥发生率显著升高(P＝0.0423)，并且随着供者HLA-C2基因数量的增加，急性排斥发生率也随之增高，即供者携带HLA-C2是急性排斥的易感因子并出现剂量效应。López-Alvarez等[7]在采用PCR-SSO方法对西班牙肝移植供-受者携带的HLA-C基因进行基因分型，研究HLA-C1/C2基因的多态性与急性排斥的关联研究，发现HLA-C1C1基因型的受者接受HLA-C1C2基因型的供肝时，受者的急性排斥发生率显著降低(P＝0.004)，HLA-C2C2基因型的受者接受HLA-C1C2基因型的供肝时，受者的急性排斥发生率显著升高(P＝0.005)。Bishara等[8]采用血清学及分子生物学方法进行HLA-A、-B、-C分型，发现供-受者HLA-C1/C2配体相匹配时，移植后受者一年内出现急性排斥的发生率显著降低(P＝0.0002)；而供-受者HLA-Bw4匹配程度对移植效果没有影响。综上可见，HLA-C1/C2与肝移植急性排斥密切相关，因此在肝移植前对供者的HLA-C1/C2基因型进行鉴定，有利于提高供肝及受者的存活率。如在肝移植前检测供者携带HLA-C2，则可提前对接受携带HLA-C2供肝的受者的急性排斥风险进行预测，并制定相应的免疫抑制治疗方案。建立适合于肝移植中HLA-C1/C2基因PCR-SSP快速鉴定方法，是当前一项急迫的任务。HLA-C基因具有高度的分子遗传多态性，截止到2018年4月，IMGT/HLA数据库(https://www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/stats.html，Release3.32)中公布的HLA-C等位基因共计3854种(其中含无效等位基因144种)，编码2644种HLA-C分子。当前区分HLA-C1/C2通常做法是：首先采用序列特异性引物-PCR(PCR-SSP)、基于Luminex流式磁珠仪的反向序列特异性寡核苷酸探针杂交(PCR-rSSO)或基于测序仪的PCR产物直接测序(PCR-SBT)的方法，鉴定并获得受检者的HLA-C基因型；然后再在IMGT/HLA数据库中查看受检者中检出的HLA-C等位基因的第80位密码子的序列及所编码的氨基酸残基，进而判定受检者的HLA-C1/C2基因型。以往的这种方法鉴定HLA-C1/C2基因型存在的不足包括：(1)HLA-C基因具有高度的分子遗传多态性,当前国际上普遍采用的Sanger测序法(PCR-SBT)及流式磁珠PCR-rSSO法进行HLA-C基因分型[6,7]，实验所需时间长、成本高、实验操作步骤多；易于出现模棱两可的检测结果(须增加其方法进行鉴定)[9]，并且实验过程中需要使用的大型贵重设备——流式磁珠仪或测序仪；(2)采用PCR-SSP法进行HLA-C基因分型，虽不需要使用大型贵重设备，但由于HLA-C等位基因水平的多态性极为丰富，需采用一系列的等位基因特异性引物、特异性扩增HLA-C位点的目的基因，PCR扩增反应的数量多，PCRSet-up(加样)及PCR产物电泳检测所需时间长；(3)无论是PCR-SSP、PCR-rSSO或PCR-SBT法进行HLA-C基因分型，在获得了受检者HLA-C基因型后，还要在IMGT/HLA数据库中查看受检者中检出的HLA-C等位基因的第80位密码子的序列及所编码的氨基酸残基，进而判定受检者的HLA-C1/C2基因型。
技术实现思路
本专利技术旨在基于HLA-C1/C2基因的序列特征和HLA-C基因组全长序列的单核苷酸多态性(SNPs)，创建一种HLA-C1/C2基因PCR-SSP快速鉴定的方法，以应用于临床肝移植急性排斥相关的快速检测、KIR-HLA与疾病关联、群体遗传学等基础和应用研究领域。为实现上述目的，本专利技术提供一种HLA-C1/C2PCR-SSP基因分型的方法，该方法包括：采用一条HLA-C基因特异性PCR扩增引物，分别与一条针对HLA-C1的组特异性PCR引物、一条针对HLA-C2的组特异性PCR引物配组，在同一PCR扩增条件下分别特异性扩增HLA-C1及HLA-C2基因；其中HLA-C基因特异性PCR扩增引物与业已公布的全部HLA-C等位基因的序列相匹配，HLA-C1的组特异性引物只能特异性扩增HLA-C1相关的目的序列，而HLA-C2组特异性PCR引物只能扩增HLA-C2相关的目的序列。HLA-C1基因特异性PCR扩增引物包括：上游引物HLA-C-F2和下游引物HLA-C1-RD，其中，上游引物HLA-C-F2的序列为：5'-CCAATCAGCGTCTMCGCAGTC-3'，位于5’-启动子区域(在HLA-C基因组全长序列中的位置为：nt-77～nt-57)；下游引物HLA-C1-RD的序列为：5'-TCTGG本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.肝移植中HLA‑C1/C2基因PCR‑SSP快速鉴定方法，其特征在于：采用一条HLA‑C基因特异性PCR扩增引物，分别与一条针对HLA‑C1的组特异性PCR引物、一条针对HLA‑C2的组特异性PCR引物配组，在同一PCR扩增条件下分别特异性扩增HLA‑C1及HLA‑C2基因；所述HLA‑C1基因特异性PCR扩增引物包括：上游引物HLA‑C‑F2和下游引物HLA‑C1‑RD，其中，所述上游引物HLA‑C‑F2的序列为：5'‑CCAATCAGCGTCTMCGCAGTC‑3'，位于5’‑启动子区域，在HLA‑C基因组全长序列中的位置为：nt‑77～nt‑57；所述下游引物HLA‑C1‑RD的序列为：5'‑TCTGGTTGTAGTAGCCGCGCAGG‑3'，位于第2外显子，在HLA‑C基因组全长序列中的位置为：nt442～nt464；所述HLA‑C2基因特异性PCR扩增引物包括上游引物HLA‑C‑F2和下游引物HLA‑C2‑RB，其中，所述上游引物HLA‑C‑F2的序列为：5'‑CCAATCAGCGTCTMCGCAGTC‑3'，位于5’‑启动子区域，在HLA‑C基因组全长序列中的位置为：nt‑77～nt‑57；所述下游引物HLA‑C2‑RB的序列为：5'‑TCTGGTTGTAGTAGCCGCGCAGT‑3'，位于第2外显子，在HLA‑C基因组全长序列中的位置为：nt442～nt464。...

【技术特征摘要】
1.肝移植中HLA-C1/C2基因PCR-SSP快速鉴定方法，其特征在于：采用一条HLA-C基因特异性PCR扩增引物，分别与一条针对HLA-C1的组特异性PCR引物、一条针对HLA-C2的组特异性PCR引物配组，在同一PCR扩增条件下分别特异性扩增HLA-C1及HLA-C2基因；所述HLA-C1基因特异性PCR扩增引物包括：上游引物HLA-C-F2和下游引物HLA-C1-RD，其中，所述上游引物HLA-C-F2的序列为：5'-CCAATCAGCGTCTMCGCAGTC-3'，位于5’-启动子区域，在HLA-C基因组全长序列中的位置为：nt-77～nt-57；所述下游引物HLA-C1-RD的序列为：5'-TCTGGTTGTAGTAGCCGCGCAGG-3'，位于第2外显子，在HLA-C基因组全长序列中的位置为：nt442～nt464；所述HLA-C2基因特异性PCR扩增引物包括上游引物HLA-C-F2和下游引物HLA-C2-RB...

【专利技术属性】
技术研发人员：邓志辉，陈瑞，
申请(专利权)人：深圳市血液中心，
类型：发明
国别省市：广东,44