一种精确分辨tRNA来源片段末端单个核苷酸差异的检测方法技术

本发明专利技术公开了一种精确分辨tRNA来源片段末端单个核苷酸差异的检测方法，包括以下步骤：(1)特异性接头序列、特异性逆转录引物与检测探针和引物序列的设计；(2)接头连接：在RNA中加入步骤(1)中设计的特异性接头序列，经过变性、退火、连接三步形成特异性末端环状发夹结构；(3)步骤(2)所述接头RNA与步骤(1)所述特异性逆转录引物混合进行逆转录；(4)TaqMan qPCR检测。本发明专利技术基于TaqMan qPCR方法，为生物体内tRF的研究提供了一种有效且便捷的可精确分辨不同tRF变体的方法，分辨率可精确至单个核苷酸差异，这对于全面深入研究tRF的生物学功能和作用机制具有有重要意义。

【技术实现步骤摘要】
一种精确分辨tRNA来源片段末端单个核苷酸差异的检测方法
本专利技术涉及生物检测技术、细胞生物学和分子生物学领域，具体涉及一种可以精确分辨tRNA来源片段末端单个核苷酸差异的检测方法。
技术介绍
tRNA来源片段是大量存在于生命有机体中的一类小片段非编码RNA，这些小RNA既可以由Dicer或RNaseZ等酶切割tRNA产生，也可以在应激状态下产生，如饥饿、低氧状态或是血管生成素的影响。研究表明机体内某些应激诱导的tRF介导应激反应，从而导致应激微粒的组装，抑制蛋白质的合成；此外，一些tRF可以影响一系列的细胞功能，例如影响癌细胞的增殖和转移、介导重要信号通路中RNA分子的失活等。根据tRF的产生方式及其与成熟tRNA或前体tRNA匹配的位置可以将tRF分为以下几类：1)在应激状态下产生，在成熟tRNA的反密码子环处被切割产生的31-40个碱基长度的tRF称为tiRNA，包括5’tiRNA，即从成熟tRNA5’末端开始到反密码子环为止；3’tiRNA，即从成熟tRNA3’末端开始到反密码子环为止；2)与miRNA相似，拥有5’末端磷酸基团和3’末端羟基基团，长度在14-30个碱基，根据其与tRNA序列的匹配位置包括产生于成熟tRNA5’末端的tRF5、产生于成熟tRNA3’末端的tRF3和产生于前体tRNA3’末端的tRF1。随着研究的深入，研究者们发现tRF在细胞的分化、发育、增殖等生命过程中的作用越来越重要，其生物学功能和分子机制的研究越来越受到人们的重视，因此精确检测特定tRF是深入研究其功能的重要的第一步。目前对于tRFs的研究，采用的最普遍的检测方式主要有两种：1)NorthernBlot：此方法的优势在于它特异性高，可检测目的片段的大小以及是否具有可变剪切出现，但是由于此法可允许探针的部分不配对性，也导致其对来源于同一tRNA的不同长度的tRF，尤其是1-2个碱基差异的tRF的分辨率降低，同时此方法与qPCR相比灵敏度较低、操作繁琐、对RNA无酶操作要求更高，使得其不适于tRF的大批量检测；2)在目标tRF3’末端加poly(A)尾后与一段带有oligo(dT)的连接序列退火形成一段更长的RNA，从而用qPCR检测，此方法简便、快速，但是特异性较低，无法精确分辨来源于同一tRNA的不同长度的tRF，尤其是1-2个碱基差异的tRF。因而本领域仍需要一种可以精确分辨tRNA来源片段末端单个核苷酸差异、并且操作简便灵敏度高的检测方法。
技术实现思路
本专利技术旨在提供一种高分辨率的检测方法来鉴定不同类型或者同一类型不同长度的tRF。本专利技术鉴于现有NorthernBlot和qPCR方法的缺陷，所提供的方法不仅可以减少操作的繁琐，提高灵敏度，而且可以提高特异性，使得分辨率高达一个碱基的差异。本专利技术所提供的技术方案：一种精确分辨tRNA来源片段末端单个核苷酸差异的检测方法，该方法包括以下步骤：(1)根据不同tRF序列设计特异性接头序列，当tRF序列为tRF5时，通过3’-Db-接头与tRF5的3’末端相连接；当tRF序列为tRF3时，通过5’-Db-接头与tRF3的5’末端相连接；同时设计特异性逆转录引物并在跨接头处设计用于TaqManqPCR检测的TaqMan探针以及上下游扩增引物；所述特异性接头序列为：3’-Db-接头：/5Phos/XTCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGAYNNNNNN，其中X、Y互为配对碱基，N为与目的tRF5序列连接端的最后6个碱基互补配对的碱基；5’-Db-接头：MMMMMMCTCAGTGCATGGGAGGGTGTGTGGTCTTGCTTGGTGTGCACTGrArG，其中M为与目的tRF3序列连接端的最后6个碱基互补配对的碱基；所述特异性逆转录引物序列为：适用于3’-Db-接头体系的序列为XTCAGTGCGAATACCTCGGACCCT；适用于5’-Db-接头体系的序列为TaqManqPCR扩增体系的下游引物；(2)连接接头：取RNA样品100-1000ng与20pmol步骤(1)所述特异性接头序列混合，与退火缓冲液形成10μl体系，于95℃变性3分钟，自然降温2小时退火后使用T4RNA连接酶于37℃孵育1小时，4℃连接过夜以形成稳定的末端发卡结构，从而得到接头RNA；(3)特异性逆转录引物的逆转录反应：使用逆转录试剂盒，将步骤(2)所述接头RNA与步骤(1)所述特异性逆转录引物混合配制逆转录体系，反应形成逆转录产物；(4)TaqManqPCR检测使用TaqManqPCR试剂盒，在步骤(3)所述逆转录产物中加入步骤(1)所述TaqMan探针以及上下游扩增引物，混合配制qPCR扩增体系，采用相对定量法根据CT值计算目标tRF的表达量。本专利技术的有益效果是：本专利技术提供的tRF检测方法采用特异性茎环结构接头序列与TaqManqPRC结合的方式，考虑了体内复杂来源的不同长度和类型的tRF的影响，具有高特异性，高分辨率，高灵敏度，广泛适用于各类型tRF。本专利技术对于精确检测细胞、体液或组织样品中的特定tRF并深入研究其生物学功能具有重要意义。附图说明图1为本专利技术方法的序列设计示意图；图2为本专利技术方法的效果图：A为电泳图，B为所选tRF序列图，C为一代测序图；图3为本专利技术方法的精确度体外实验验证图：A为只使用Gly-GCC_29的特异性接头序列，B为只使用Gly-GCC_30的特异性接头序列，C为只使用Gly-GCC_31的特异性接头序列；图4为本专利技术适用于一种特定tRF5在体内切割位点验证图：A为生物信息学分析图，B为本专利技术实验验证图；图5为本专利技术适用于一种特定tRF3在体内切割位点验证图：A为生物信息学分析图，B为本专利技术实验验证图。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。本专利技术提供的一种精确分辨tRNA来源片段末端单个核苷酸差异的检测方法，具体实施步骤如下：(1)根据不同tRFs序列设计特异性接头序列，当tRF序列为tRF5时，通过3’-Db-接头与tRF5的3’末端相连接；当tRF序列为tRF3时，通过5’-Db-接头与tRF3的5’末端相连接，同时设计特异性逆转录引物并跨接头处设计用于TaqManqPCR检测的TaqMan探针以及上下游扩增引物；(2)连接接头：按照下表1的配比准备变性退火反应体系：表1RNA寡核苷酸序列退火缓冲液(5×)2μl步骤(1)所述特异性接头序列20pmol总RNA1μg无核酸酶去离子水To10μl95℃加热变性3分钟，室温自然降温约2小时后，使用T4RNA连接酶(NEB)，按照下表2的配比准备连接反应体系：表237℃孵育1小时，4℃连接过夜，以形成稳定的末端发卡结构，从而得到接头RNA。(3)特异性逆转录引物的逆转录反应：使用PrimeScriptTMRTreagentKit(Takara)，按照下表3配制逆转录反应体系：表35×PrimeScript缓冲液2μlPrimeScript逆转录酶混合体系I0.5μl步骤(1)所述特异性逆转录引物(2μM)0.5μl内参基因的特异性逆转录引物(2本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种精确分辨tRNA来源片段末端单个核苷酸差异的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)根据不同tRF序列设计特异性接头序列，当tRF序列为tRF5时，通过3’‑Db‑接头与tRF5的3’末端相连接；当tRF序列为tRF3时，通过5’‑Db‑接头与tRF3的5’末端相连接；同时设计特异性逆转录引物并在跨接头处设计用于TaqMan qPCR检测的TaqMan探针以及上下游扩增引物；(2)连接接头：取RNA样品100‑1000ng与20pmol步骤(1)所述特异性接头序列混合，与退火缓冲液形成10μl体系，于95℃变性3分钟，自然降温2小时退火后使用T4 RNA连接酶于37℃孵育1小时，4℃连接过夜以形成稳定的末端发卡结构，从而得到接头RNA；(3)特异性逆转录引物的逆转录反应：使用逆转录试剂盒，将步骤(2)所述接头RNA与步骤(1)所述特异性逆转录引物混合配制逆转录体系，反应形成逆转录产物；(4)TaqMan qPCR检测：使用TaqMan qPCR试剂盒，在步骤(3)所述逆转录产物中加入步骤(1)所述TaqMan探针以及上下游扩增引物，混合配制qPCR扩增体系，采用相对定量法根据CT值计算目标tRF的表达量。...

【技术特征摘要】
1.一种精确分辨tRNA来源片段末端单个核苷酸差异的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)根据不同tRF序列设计特异性接头序列，当tRF序列为tRF5时，通过3’-Db-接头与tRF5的3’末端相连接；当tRF序列为tRF3时，通过5’-Db-接头与tRF3的5’末端相连接；同时设计特异性逆转录引物并在跨接头处设计用于TaqManqPCR检测的TaqMan探针以及上下游扩增引物；(2)连接接头：取RNA样品100-1000ng与20pmol步骤(1)所述特异性接头序列混合，与退火缓冲液形成10μl体系，于95℃变性3分钟，自然降温2小时退火后使用T4RNA连接酶于37℃孵育1小时，4℃连接过夜以形成稳定的末端发卡结构，从而得到接头RNA；(3)特异性逆转录引物的逆转录反应：使用逆转录试剂盒，将步骤(2)所述接头RNA与步骤(1)所述特异性逆转录引物混合配制逆转录体系，反应形成逆转录产物；(4)TaqManqPCR检测：使用TaqManqPCR试剂盒，在步骤(3)所述逆转录产物中加入步骤(1)所述TaqMan探针以及上下游扩增引物，混合配制qPCR扩增体系，采用相对定量法根据CT值计算目标tRF的表达量。2.根据权利要求1所述的一种精确分辨tRNA来源片段末端单个核苷酸差异的检测方法，其特征在于，所述步骤...

【专利技术属性】
技术研发人员：陆燕，余梦倩，刘鹏渊，周莉媛，
申请(专利权)人：浙江大学医学院附属妇产科医院，
类型：发明
国别省市：浙江,33