引物5’端反向互补的荧光PCR制造技术

引物5'端反向互补的荧光PCR，属于分子生物学‑核酸扩增技术领域，其特征是一对引物5'端添加一段序列反向互补的荧光PCR扩增，带来扩增产物间末端互补，靶产物3'末端也可以互为模板、互为引物而增加扩增效率，在常规PCR指数放大10

【技术实现步骤摘要】
引物5’端反向互补的荧光PCR
：本专利技术属于分子生物学及核酸检验的荧光PCR
，具体地增加引物5'端互补序列以超过指数放大来提高灵敏度和限制引物非特异性的单管一步法实时荧光PCR。
技术介绍
：多聚酶链反应PCR是在1953年Watson建立的DNA双螺旋模型及半保留复制法则基础上，体外(试管内)模拟自然基因复制的核酸扩增技术，早在1971年Khorana就已发表了一核酸体外扩增(J.Molec.Biol.,56:341)相关论文；但直到1985年美国Cetus公司Mullis想到了PCR本质-指数扩增或几何级数式放大的巨大威力,才专利技术了一对特异引物结合、复制靶分子基因,模拟天然DNA半保留复制的PCR技术，再经过一系列发展和耐热聚合酶、热循环仪的专利技术、应用，Cetus公司于1987年申请了首个PCR专利技术专利(USPatent4,683,202)。扩增利用热循环高效解链，一般经高温变性：靶DNA经94℃使双链解离成为单链；退火复性：降温至54℃左右使过量引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；引物延伸：升温至72℃左右，DNA单链模板—引物结合物在耐热DNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，遵循碱基反向配对复制，引物末端按5'→3'方向延伸、合成一条新的与模板DNA链反向互补的复制链，子代一半新链一半母链半保留复制；不断重复循环变性--退火--延伸三过程，这种新链又可成为下次循环的模板，靶分子以2n级数产生更多的新链。各种PCR方法，改进不断涌现,专利技术，包括反转录RT-PCR,原位PCR,连接酶链反应(LCR)，标记PCR(Labeledprimers-PCR)，反向PCR(reversePCR)，不对称PCR(asymmetricPCR)，降落PCR(touchdownPCR)，重组PCR(recombinantPCR)，多重PCR(multiplexPCR)，免疫-PCR(immuno-PCR)，mRNA差异PCR，链替换扩增(SDA)，依赖核酸序列的扩增(NASBA)，转录依赖的扩增系统(TAS)，Qβ复制酶(Q-betareplicase)催化RNA扩增,滚环扩增(RCA),环介导的等温扩增(LAMP)等。由于常规终末PCR因同样量的样本经PCR超级放大以后变化太大而产量不均一，致使难以定量检测，传统的终末/终点PCR只能PCR后凝胶电泳来区分特异与非特异扩增条带；1997年采用动态实时检测扩增对数期的循环数与靶初始量成反比(反对数关系)的实时荧光PCR(Real-timePCR)技术实现了从定性测定到精确定量的飞跃，根据发光原理有以SYBRGreenⅠ等结合产物DNA双链小沟后使发射荧光增强1000倍的染料法实时荧光PCR和各种荧光标记杂交探针实时PCR两大类(BioTechniques1997,22:130-138)。超级灵敏度的指数放大或几何级数放大是PCR最核心的本质或优点，靶分子以2n级数放大,常规30个热循环反应230约等于109放大倍数,扩增放大倍数似原子裂变链式反应难以想象,也是一般线性放大检测方法无可比拟的,灵敏度远远大于普通检测方法的放大倍数；实时荧光PCR近40个循环反应可达飞克fg/ml甚至接近个位数分子检测。这些PCR方法灵敏度仍显不足，随后开始出现外侧与内侧引物两步扩增的巢式PCR(JMedVirol,30-2:85)，其采用外侧引物预扩增15-20个循环来提高灵敏度，再加以内侧引物继续扩增25-30个循环以超过40个循环指数扩增的极高灵敏度甚至为单个靶分子检出提供了可能；但巢式PCR外侧引物增加了系统复杂性进而增加了两轮PCR非特异性，外引物的残留促进内侧引物非特异扩增，将一般常规引物本底Ct值30个循环的非特异性提升至Ct值＜25个循环以前的本底非特异性；巢式两轮PCR增加的非特异性抵消了第一轮或外侧引物预扩增的放大作用。因此，过多的40个循环次数及过多引物亦带来PCR顽固的非特异性，PCR非特异性也像特异性源于引物序列，引物特异性任何一点降低或与靶一丁点不匹配导致扩增速率落下了,甚至一端完全配对扩增也仅是线性放大，自然远远赶不上特异的指数扩增或几何级数放大；反过来说,只要是靶指数扩增或几何级数放大，PCR扩增检测就具有足够高特异性。非特异性同理，各种常规检验方法遇见的非特异性原因虽也存在于PCR技术,但终究赶不上指数扩增放大，仅一条引物非特异结合线性扩增远远赶不上指数非特异性,只有一对引物均非特异结合、延伸的扩增才是唯一指数非特异性原因,内源引物间互为模板、互为引物的二聚体PrimerDimer(PD)扩增及PD产物再扩增是PCR非特异性本质,也是其难以克服的根本原因。一对引物间3'末端反向互补是指数非特异性主因，一般3'末端数个碱基连续反向互补的引物对于不加模板的本底PCR扩增反应中约从几个至十几个循环处即出现引物二聚体PD扩增；一对常规设计的引物于本底PCR反应30个循环开始出现显著的PD非特异性扩增，并遮盖位于30-38循环的数千以下靶分子的低浓度样本检测，这也是常规终末PCR只进行30个循环反应的最主要内在原因。目前实时荧光PCR仍有限的灵敏度和一定程度的引物非特异性均妨碍了极低浓度样本检测或单分子检出。一对高度同序引物绝没有引物非特异性,消除引物指数非特异性只能溯源于其碱基序列。Hands技术(Homo-Tagassistednon-dimersystem,NucleicAcidsRes.Vol.25,No16:p3235-3241)采用完全同序引物Tag通过引物二聚体单链两端自身结合竞争游离引物,不仅显著抑制PD非特异性,但也没有选择地减低靶特异性扩增效率。单链结合蛋白SingleStrandBinding-protein(SSB)、基因32蛋白和全引物结合反义碱基Oligo能显著降低优化的引物非特异性,也都严重地影响靶特异性扩增效率及扩增曲线的线性关系。中国专利(CN201010105371.8和PCT/CN2013/088054)采用部分同序引物部分抑制PD扩增,将“同序”置于引物中部偏3'端能最大化地选择性抑制PD扩增而不影响靶扩增效率；PCR添加与引物中部同序部位配对结合的含反义碱基Oligo,因其仅保留结合功能而没有模板和引物作用,能进一步特异选择性地放大这种作用。在无3'端反向互补常规引物设计原则基础上,选择中部部分同序引物对和杂交中部反义碱基Oligo于实时荧光PCR40个循环反应内消除内源PD非特异性扩增干扰。由于UDG降解靶扩增产物有效，但酶解非a结尾引物二聚体因产生带互补碱基的引物“碎片”，极易再次聚合而无效；采用a结尾引物的PD产物可以使用dU代替dT底物来形成连接处含dU二聚体PD，使用UDG酶可有效降解a结尾引物的外源含dU引物二聚体PD产物气雾胶(中国专利CN201810001086.8)。定量检验方法还有一条稀释定量法思路，即通过样本倍比稀释靶分子直至无靶分子反应再算稀释倍数的倍比稀释定量方法；随后出现了基于样本有限稀释和泊松分布计数的数字化定量PCR理念。即确保阳性单个分子或单个以上分子均有检测信号而定为1、阴性绝对无反应信号而定为0的条件下，样本稀释、分散至大量的微型分隔单本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.引物5'端反向互补的荧光PCR，其特征是一对引物5'端添加一段序列反向互补的荧光PCR扩增，带来扩增产物间末端互补，靶产物3'末端间也可以互为模板、互为引物而增加扩增效率，以＞2n级数放大策略而增敏；另一面引物5'端互补不会延伸反而抑制原引物对3'末端间的聚合非特异性，联合3'最末端倒数第1‑2个碱基A/a腺嘌呤结尾的引物+UDG酶解dU代替dT的扩增产物,和矿物油封闭来杜绝产物尤其引物二聚体PD气雾胶污染，具有如以下技术途径：(1)一对引物5'端均加上一段短于引物长度2‑5b的反向5‑10b互补人工序列，根据扩增产物链3'末端与引物互补并而为下一轮循环反应模板的现象，一对5'互补引物扩增产物链3'末端间相应地也互相互补，扩增产物3'末端不仅为后续循环结合引物的模板，产物3'末端人工序列间也可以互为模板、互为引物结合、延伸，放大效率超过＞2n指数或几何级数，实现增强PCR扩增灵敏度；(2)利用引物5'自身的序列作为“人工互补序列”，将一条引物5'端序列对应的5‑8b反向互补序列按5'‑3'方向加到另一条引物5'端前面，反之，另一条引物5'端的反向互补序列加一段至对应引物5'前面，形成两段连续5'反向互补序列而增敏，原引物与添加序列共用了一段引物5'自身序列，原引物序列与添加的序列间可插入一短4b序列限制酶切位点，使增敏PCR产物酶切后长度一致以便于电泳回收和有助于降解PD产物污染。...

【技术特征摘要】
1.引物5'端反向互补的荧光PCR，其特征是一对引物5'端添加一段序列反向互补的荧光PCR扩增，带来扩增产物间末端互补，靶产物3'末端间也可以互为模板、互为引物而增加扩增效率，以＞2n级数放大策略而增敏；另一面引物5'端互补不会延伸反而抑制原引物对3'末端间的聚合非特异性，联合3'最末端倒数第1-2个碱基A/a腺嘌呤结尾的引物+UDG酶解dU代替dT的扩增产物,和矿物油封闭来杜绝产物尤其引物二聚体PD气雾胶污染，具有如以下技术途径：(1)一对引物5'端均加上一段短于引物长度2-5b的反向5-10b互补人工序列，根据扩增产物链3'末端与引物互补并而为下一轮循环反应模板的现象，一对5'互补引物扩增产物链3'末端间相应地也互相互补，扩增产物3'末端不仅为后续循环结合引物的模板，产物3'末端人工序列间也可以互为模板、互为引物结合、延伸，放大效率超过＞2n指数或几何级数，实现增强PCR扩增灵敏度；(2)利用引物5'自身的序列作为“人工互补序列”，将一条引物5'端序列对应的5-8b反向互补序列按5'-3'方向加到另一条引物5'端前面，反之，另一条引物5'端的反向互补序列加一段至对应引物5'前面，形成两段连续5'反向互补序列而增敏，原引物与添加序列共用了一段引物5'自身序列，原引物序列与添加的序列间可插入一短4b序列限制酶切位点，使增敏PCR产物酶切后长度一致以便于电泳回收和有助于降解PD产物污染。2.根据权利要求1所述的引物5'端反向互补的荧光PCR，其特征在于：所述上下游原引物具有中部6-8b同序/相同碱基序列A结尾的引物，用于进一步减少引物二聚体程度/推后引物二聚体本底扩增Ct值；加入引物中部互补的反义碱基5-9b中部干扰Oligo寡核苷酸增效剂，选择性抑制PCR反应内的引物二聚体扩增本底Ct值。3.根据权利要求1所述的引物5'端反向互补的荧光PCR，其特征在于：所述原引物中部6-8b同序A结尾引物的尾碱基A前或后紧邻碱基变一个RNA，让A结尾和RNA碱基联合共同消化引物二聚体PD产物污染。4.根据权利要求2所述的引物5'端反向互补的荧光PCR，其特征在于：所述的引物设计在常规引物选取基础上修改和增补一些减少本底、5'端反向互补引物设计原则：(1)选取一对靶特异性基因跨度100-300bp两端序列17-22个核苷酸碱基长度作为上下游引物，且引物3'末端间不能有连续反向互补；(2)选取靶基因跨度300bp以内6-8b“倒置重复”置于一对引物离3'端2-6个碱基以外的中部作为中部同序引物；(3)5'端反向互补—采用5-7b对侧原引物5'反向序列作为添加人工序列加至相对引物前面，人工添加的序列与原引物序列间插入一短4b序列限制酶切位点；(4)一对引物的3'最末碱基选择A/AC结尾使扩增产物对应dU位于二聚体的原引物连接中间处；不要选氢键强“错配”多的G结尾,亦不要选氢键弱/特异性差的T结尾,更不能采用重复双GG/TT结尾。5.根据权利要求1所述的引物5'端反向互补的荧光PCR，其特征在于，所述的引物浓度为3-6μM作为50×倍或终浓度0.1μM，随不同样本最低浓度检测要求及系统本底值需要调整最...

【专利技术属性】
技术研发人员：江洪，江和来，
申请(专利权)人：江洪，
类型：发明
国别省市：广东,44