本发明专利技术涉及一种抗菌肽的制造方法，尤其涉及一种通过将抗菌肽遗传基因融合到在大肠杆菌中以不溶性形态表达的绿色荧光蛋白遗传基因并引进到大肠杆菌中进行表达之后再去除绿色荧光蛋白并收取抗菌肽的过程而批量地制造抗菌肽的方法。如上所述的本发明专利技术能够通过提供一种制造工程简单、经济性良好且生产收率较高的抗菌肽的制造方法，在因为多重耐药性微生物的急剧增加而急需开发出具有能够对上述耐药性菌株进行杀灭的全新作用机制的抗生素的制药以及饲料产业，提供能够替代现有的抗生素的天然抗生素。此外，本发明专利技术能够通过利用以酸处理方式切割氨基酸的方式替代现有的使用氰化溴的方式，在从不溶性蛋白纯化出目标蛋白质的过程中节省成本、降低工程的危险性并更快速地完成所需的作业。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】包含抗菌肽的不溶性融合蛋白以及利用上述不溶性融合蛋白的抗菌肽制造方法
本专利技术涉及一种由绿色荧光蛋白(GreenFluorescentprotein，GFP)和抗菌肽(Antimicrobialpeptide，AMP)结合而成的融合蛋白以及利用上述融合蛋白的抗菌肽的批量制造方法，尤其涉及一种通过将抗菌肽融合到在大肠杆菌中以不溶性形态表达的绿色荧光蛋白并引进到大肠杆菌中进行表达之后再去除绿色荧光蛋白并收取抗菌肽的过程而批量地制造抗菌肽的方法。
技术介绍
从微生物到高等生物位置的所有生物，均具有用于保护自己免受外部有害环境侵害的自身独有的固有防御系统。周边所存在的微生物甚至于菌丝类都会通过生成具有抗菌活性的自身防御物质即抗菌肽而构建先天性免疫系统，提供在抗原-抗体反应之前保护自身免受外部有害因素侵害的第一轮屏障。此外，人类在继青霉素之后开发出了很多种类型的抗生素并进行使用，但是近年来与过去不同，对如上所述的抗生素具有耐药性的菌株呈现出了非常快速的增长趋势。尤其是，对两种以上的不同抗生素、抗菌剂呈现出耐药性的多重耐药性微生物急剧增加，所以目前急需开发出一种能够对如上所述的耐药性菌株进行杀灭的具有全新作用机制的抗生素。因为如上所述的原因，存在于大自然中的抗菌肽作为全新抗生素的候选物质而备受关注，因为是通过与目前所使用的化合物物性的抗生素不同的作用机制呈现出抗菌活性，因此有望解决对抗生素具有耐药性的菌株相关的问题。因此，很多人在努力尝试直接使用自然界中所存在的抗菌肽或合成使用其类似物，但是因为抗菌肽在提升抗菌活性的同时还会导致细胞毒性的标准即红细胞溶血现象的增加，因此在实际应用方面受到很多限制。而且，为了实现在抗菌肽的商用化方面最为重要的因素即大规模生产，同样进行了各种各样的研究与尝试，但是直至目前为止并没有达到可适用于产业领域的水准。这是因为当通过化学合成的方法生产抗菌肽时，其经济性较差，而当通过利用微生物的遗传基因工程技法生产抗菌肽时，虽然其经济性良好，但却会因为所表达的抗菌肽阻碍宿主微生物的生长而导致抗菌肽的生产收率极低的问题。因此，本专利技术人专利技术了一种可通过简单且经济性良好的方式实现抗菌肽的批量生产的方法，通过利用可轻易实现遗传基因操作且经济性良好的大肠杆菌表达系统并将在大肠杆菌中以不溶性形态表达的绿色荧光蛋白作为载体对结合到抗菌肽中的融合蛋白的表达进行诱导之后再通过从上述融合蛋白中分离出抗菌肽的过程而制造抗菌肽，从而解决因为蛋白质的加水分解而导致的阻碍抗菌肽生成的问题以及因为抗菌肽阻碍大肠杆菌的生长而导致的抗菌肽生产收率降低的问题。作为相关的现有技术，包括大韩民国注册专利第10-0958095号(利用翻译偶联系统的抗菌肽的批量表达方法)、大韩民国公开专利第10-2012-0062504号(在细胞表面表达的抗菌肽聚合物)等。专利内容本专利技术的目的在于提供一种能够通过将不溶性的绿色荧光蛋白作为载体进行使用并利用大肠杆菌表达系统制造出抗菌肽的制造工程简单、经济性良好且生产收率较高的抗菌肽制造方法。为了实现上述目的，本专利技术提供一种由能够通过酸处理实现切割以及活性化的抗菌肽与绿色荧光蛋白结合而成的不溶性融合蛋白。上述抗菌肽连续排列且在上述抗菌肽的N-末端、C-末端或上述的连接部上能够连接Asp-Pro氨基酸序列。上述连续排列的抗菌肽能够以3拷贝存在。上述天冬氨酸-脯氨酸(Asp-Pro)氨基酸序列能够通过酸处理实现切割，上述酸处理能够通过投入HCl而执行。此外，本专利技术提供一种包括以序列编号24记录的氨基酸序列的不溶性融合蛋白。此外，本专利技术提供一种包括用于对上述不溶性融合蛋白进行编码的以序列编号21记录的碱基序列的遗传基因。此外，本专利技术提供一种将上述重组表达载体引进到宿主细胞中的转化体。上述宿主细胞能够是大肠杆菌。此外，本专利技术提供一种包括：(1)在培养液中对利用以序列编号21记录的碱基序列进行重组的转化体进行培养的步骤；(2)从上述培养液回收转化体的步骤；(3)从转化体获取蛋白质的步骤；以及，(4)通过对上述蛋白质进行酸处理而分离出抗菌肽的步骤；的抗菌肽的制造方法。上述蛋白能够以包涵体形态表达。上述抗菌肽连续排列且在上述抗菌肽的N-末端、C-末端或上述的连接部上能够连接天冬氨酸-脯氨酸(Asp-Pro)氨基酸序列。上述连续排列的抗菌肽能够以3拷贝存在。上述天冬氨酸-脯氨酸(Asp-Pro)氨基酸序列能够通过酸处理实现切割，上述酸处理能够通过投入HCl而执行。如上所述的本专利技术能够通过提供一种制造工程简单、经济性良好且生产收率较高的抗菌肽的批量制造方法，在因为多重耐药性微生物的急剧增加而急需开发出全新抗生素的时代背景下将存在于大自然中的抗菌肽适用于制药以及饲料产业等。此外，本专利技术能够通过利用以酸处理方式切割氨基酸的方式替代现有的使用氰化溴的方式，在从不溶性蛋白纯化出目标蛋白质的过程中节省成本、降低工程的危险性并更快速地完成所需的作业。附图说明图1a是用于不溶性绿色荧光蛋白与抗菌肽的融合的重组载体的模式图。图1b是重组的r5M-172AMP173的氨基酸序列(下划线：r5M-GFP序列，黑色阴影：连接序列以及蛋氨酸部分，灰色阴影：AMP的氨基酸序列位(需要注意的是，以灰色阴影标记的AMP并不是氨基酸序列，而是抗菌肽(Antimicrobalpeptide)的缩写))。图1c是从不溶性绿色荧光蛋白纯化出抗菌肽的过程的模式图。图2是重组的r5M-172(PG1)3173的氨基酸序列(下划线：r5M-GFP序列，灰色阴影且有下划线：从天冬氨酸置换成丝氨酸的部位，黑色阴影：连接序列以及天冬氨酸-脯氨酸(Asp-Pro)结合部位，灰色阴影但无下划线：PG1的氨基酸序列)。图3是在对已插入r5M-172PG1173遗传基因的pET30b表达载体进行引进的大肠杆菌中，通过光学密度对已诱导以及未诱导蛋白质表达时的大肠杆菌的生长曲线进行测定的图表。图4a是利用电子显微镜对从已插入r5M172PG1173遗传基因的转化体生成的蛋白质(箭头)形成包涵体的过程进行拍摄的照片。图4b、图4c以及图4d是在进行免疫化学标记之后利用电子显微镜对从已插入r5M172PG1173遗传基因的转化体生成的蛋白质(箭头)形成包涵体的过程进行拍摄的照片。图5是以所有细胞蛋白为样本并利用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，对大肠杆菌中已插入r5M-172PG1173遗传基因的pET30b表达载体在时间流逝(3小时、4小时、5小时)时的r5M-172PG1173蛋白生成情况进行确认的结果。图6a是利用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对各个步骤中所表达的r5M-172PG1173蛋白进行确认的结果。图6b是利用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对各个步骤中的r5M-172PMAP36173蛋白进行确认的结果。图7a以及图7b是利用三羟甲基氨基甲烷-三(羟甲基)甲基甘胺酸(tris-tricine)十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对蛋白质纯化的各个步骤中所提取出的蛋白质样本的纯度进行分析的结果。图7c是利用蛋白印记法(westernblot)对所纯化的PG1进行确认的结果。具体实施本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种不溶性融合蛋白，其特征在于：由能够通过酸处理实现切割以及活性化的抗菌肽(Antimicrobial peptide，AMP)与绿色荧光蛋白(Green Fluorescent protein，GFP)结合而成。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.01.27 KR 10-2016-00099701.一种不溶性融合蛋白，其特征在于：由能够通过酸处理实现切割以及活性化的抗菌肽(Antimicrobialpeptide，AMP)与绿色荧光蛋白(GreenFluorescentprotein，GFP)结合而成。2.根据权利要求1所述的不溶性融合蛋白，其特征在于：上述酸处理通过投入HCl而执行。3.根据权利要求1所述的不溶性融合蛋白，其特征在于：上述抗菌肽连续排列且在上述抗菌肽的N-末端、C-末端或上述的连接部上连接天冬氨酸-脯氨酸(Asp-Pro)氨基酸序列。4.根据权利要求3所述的不溶性融合蛋白，其特征在于：上述连续排列的抗菌肽以3拷贝(copies)存在。5.根据权利要求3所述的不溶性融合蛋白，其特征在于：上述天冬氨酸-脯氨酸(Asp-Pro)氨基酸序列通过酸处理而实现切割。6.一种不溶性融合蛋白，其特征在于，包括：以序列编号24记录的氨基酸序列。7.一种遗传基因，其特征在于，包括：用于对第6项所述的不溶性融合蛋白进行编码的以序列编号21记录的碱基序列。8.一种重组表达载...
【专利技术属性】
技术研发人员：朴灿奎，
申请(专利权)人：建国大学校产学协力团，
类型：发明
国别省市：韩国,KR
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