本发明专利技术公开了检测WU多瘤病毒的荧光定量PCR引物和探针及其应用，所述上游引物具有SEQ ID No.1的核苷酸序列；所述下游引物具有SEQ ID No.2的核苷酸序列；所述探针具有SEQ ID No.3的核苷酸序列。本发明专利技术能够快速、准确、高效地检测出样品中的WU多瘤病毒，具有较高的灵敏度和特异性。该套引物和探针可用于多种方面，如临床疾病诊断、抗病毒药物筛选、环境监测与评价、卫生监督与口岸卫生检疫、流行病学调查等。
Primers and probes for detection of WU PCR and its application
The invention discloses fluorescent quantitative PCR primers and probes for detecting WU polyoma virus and their applications. The upstream primers have SEQ ID No.1 nucleotide sequence, the downstream primers have SEQ ID No.2 nucleotide sequence, and the probe has SEQ ID No.3 nucleotide sequence. The invention can detect WU polyoma virus in samples quickly, accurately and efficiently, and has high sensitivity and specificity. This set of primers and probes can be used in many aspects, such as clinical disease diagnosis, antiviral drug screening, environmental monitoring and evaluation, health supervision and port health quarantine, epidemiological investigation, etc.
【技术实现步骤摘要】
用于检测WU多瘤病毒的荧光定量PCR的引物和探针及其应用
本专利技术属于微生物检测技术，尤其是人呼吸道感染WU多瘤病毒的核酸检测技术范畴的用于检测WU多瘤病毒的荧光定量PCR的引物和探针及其应用。
技术介绍
WU病毒是2007年5月由美国的AnneM.Gaynor等学者首先通过分子病毒筛查方法从急性呼吸道感染患儿的鼻咽抽取物中发现的。该病毒属于多瘤病毒科，是人类疾病相关的第四种多瘤病毒。暂时将该病毒称为WU(WashingtonUniversity)病毒(与人类多瘤病毒双字母病毒命名一致)。WUPyV在结构上，它与其它多瘤病毒一样，由20面体衣壳和一闭合环状双链DNA组成；在基因组成上，却与多瘤病毒属中BK病毒(BKpolyomavirus)、JC病毒(JohnCunninghampolyomavirus)有明显不同，而与KI病毒(KarolinskaInstitutepolyomavirus)有相似之处。WUPyV基因组有5229bp(GC含量占39％)，编码大T抗原(LTAg)、小T抗原(STAg)及3种核衣壳蛋白(VP1、VP2、VP3)。早期区(earlyregion)基因编码LTAg和STAg，而在相反链上晚期区基因编码核衣壳蛋白(VP1、VP2、VP3)。早期编码区和晚期编码区被中间调控区分开，该区是一个位于复制起点晚期侧富含AT区域，具有典多瘤病毒特征。在该调控区大多数多瘤病毒存在四个相同序列，而WUPyV调控区存在LTAg三个相同序列结合位点(GAGGC)和一个序列不同结合位点(TAGGC)。该调控区独特之处是它包括两个部分重叠LTAg的结合位点，彼此之间还存在着细微差异。而在早期编码区，有一个由194个氨基酸组成开放阅读框，可能编码STAg。LTAg同样具有高度保守性，该区包括N(氨基)端DnaJ区六肽序列HPDKGG、结合Rb必需L×C×E序列、DNA结合区、锌指结构和ATPase-p53结合区保守模序GP×××GKT以及G×××VNLE。到目前为止，不同国家检出WUPyV核苷酸序列均表现出高度一致性。目前，WUPyV在小儿呼吸道感染中的检测率在全世界各地报道差异较大，约在0.7％～9％之间。该病毒在美国AnneM.Gaynor和Binh-MinhLe等的研究中的检出率分别是0.7％和2.7％，而澳大利亚、法国、德国、荷兰和我国的检出率分别是4.5％、2.4％、4.9％、9％和4.2％。加拿大的检出率为2.5％(有症状)和6.4％(无症状)，而韩国的检出率相对高，达7％(有症状)和4.2％(无症状)，不同检出率差异是WUPyV生物学特征所致，还是因实验设计不同而异，还待进一步研究。大多数报道称该病毒可贯穿全年感染，但多数发生在冬季。美国Binh-MinhLe等从2003年7月到2004年6月研究中发现2003年7月是第一个季节性高峰，2004年4、5月是第二个高峰；在澳大利亚多数病例发生于冬末夏初，高峰在10月和12月；在加拿大检出WUPyV阳性病例主要集中在12月至次年4月；在韩国集中在5、6、12月，即冬末夏初；而在德国主要集中在冬季；在荷兰主要集中在呼吸道感染高发季节即冬春季；在法国则无明显季节性高峰；在我国标本采集来自各个月份，但主要集中在秋冬季。国内的庄婉莉等对15份WUPyV感染阳性的标本的DNA进行基因序列检测，结果显示WUPyV的VP2基因片段与GenBank库中韩国毒株的VP2衣壳蛋白基因的同源性为99.6％，与美国、浙江和北京的毒株的同源性均为100％。这些均表明WUPyV可能是一种高度保守的病毒。在我国，浙江、北京、华南地区等学者也相继报道了从急性呼吸道感染的婴幼儿标本中检测出该病毒。我们研究小组，于2007年11月17日运用基因扩增方法对该院1390例小儿急性呼吸道感染标本进行检测，从中检出了5例WU多瘤病毒，其阳性率是0.4％。该病例是2个3岁的女婴3个2岁男婴。他们因“发热、咳嗽一周”入院，经住院治疗十天后痊愈出院。11月22日他们对该病毒进行克隆和全基因测序，于12月4日向世界公布该病毒全基因序列结果，被美国基因数据库(Genbank)收录，并命名为“CLFF”(中国林峰第一株，其全基因序列号为EU296475)。这是亚洲首个该病毒的基因图谱。目前主要发现其存在于5岁以下的呼吸道感染的患儿中，且常与其他病毒合并感染。其主要临床表现是咳嗽、上呼吸道感染症状、喘息等，故该病毒的发现对于小儿呼吸道感染疾病病毒病原谱的研究具有重要意义。本课题组对WUPyV病毒中的VP1基因进行成功表达，并将纯化的抗原结合WesternBlot和ELISA技术，建立了该病毒的蛋白质水平检测体系。荧光定量PCR技术是近些年发展起来的分子生物学技术，以其快速、准确、可以定量等特点被广泛应用到各种检测体系中。本研究的目的是通过已报道的WUPyV病毒基因序列，选取VP1基因中约199bp片断，设计引物和检测探针，建立WUPyV病毒的荧光定量PCR检测方法。目前，缺乏一种能够快速、准确、高效地检测出样品的用于检测WU多瘤病毒的荧光定量PCR的引物和探针及其应用。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种能够快速、准确、高效地检测出样品的用于检测WU多瘤病毒的荧光定量PCR的引物和探针及其应用。为达到上述目的，本专利技术采用了下列技术方案：本专利技术的一种用于检测WU多瘤病毒的荧光定量PCR的引物和探针，所述上游引物具有SEQIDNo.1的核苷酸序列；所述下游引物具有SEQIDNo.2的核苷酸序列；所述探针具有SEQIDNo.3的核苷酸序列。进一步地，所述的引物和探针的长度在20-30碱基之间。进一步地，所述的引物和探针序列5’或3’末端化学标记(修饰)不同的基团。更进一步地，所述的探针5’端标记FAM或其他荧光基团，3’端标记TAMRA或其他荧光淬灭基团。本专利技术的一种WU多瘤病毒的荧光定量PCR扩增体系，所述的荧光定量PCR反应扩增体系：10×buffer，5.0ul；Mg2+，3.5mM；dNTP，200uM；上下游引物均为0.2uM；TanMan探针，50nM；Taq酶，1.25U；模板，2.0ul；加去离子水至50ul。PCR反应为：94℃5min；94℃15s、58℃45s，共40循环。本专利技术用于检测WU多瘤病毒的荧光定量PCR的引物和探针在利用引物和探针可对样品中的人WU多瘤病毒相应基因进行检测中的应用。本专利技术用于检测WU多瘤病毒的荧光定量PCR的引物和探针在基于荧光定量PCR技术检测中的应用。有益效果：本专利技术能够快速、准确、高效地检测出样品中的WU多瘤病毒，具有较高的灵敏度和特异性。与现有技术相比，本专利技术具有如下优点：(1)利用该套引物和探针，在一定条件下，可对样品中的WU多瘤病毒相应基因进行检测，尤其适用于基于荧光定量PCR技术的检测。该套引物和探针可用于多种方面，如临床疾病诊断、抗病毒药物筛选、环境监测与评价、卫生监督与口岸卫生检疫、流行病学调查等。(2)本专利技术该套引物和探针根据GenBank上WU多留病毒全基因组序列(EU296475)设计，寡核苷酸序列长度在20-35碱基之间，具有较高的灵敏度和特异性。附图说明图1为本专利技术的WU多瘤病毒基因片段重组质粒的10倍梯度稀释液(本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于检测WU多瘤病毒的荧光定量PCR的引物和探针，其特征在于：所述上游引物具有SEQ ID No.1的核苷酸序列；所述下游引物具有SEQ ID No.2的核苷酸序列；所述探针具有SEQ ID No.3的核苷酸序列。
【技术特征摘要】
1.一种用于检测WU多瘤病毒的荧光定量PCR的引物和探针，其特征在于：所述上游引物具有SEQIDNo.1的核苷酸序列；所述下游引物具有SEQIDNo.2的核苷酸序列；所述探针具有SEQIDNo.3的核苷酸序列。2.根据权利要求1所述的用于检测WU多瘤病毒的荧光定量PCR的引物和探针，其特征在于：所述的引物和探针的长度在20-30碱基之间。3.根据权利要求1所述的用于检测WU多瘤病毒的荧光定量PCR的引物和探针，其特征在于：所述的引物和探针序列5’或3’末端化学标记(修饰)不同的基团。4.根据权利要求1所述的用于检测WU多瘤病毒的荧光定量PCR的引物和探针，其特征在于：所述的探针5’端标记FAM或其他荧光基团，3’端标记T...
【专利技术属性】
技术研发人员：邬晓乐，侯建毅，赵风强，张军龙，邬江，姬志娟，
申请(专利权)人：北京博奥森生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。