G72蛋白及其三种突变体蛋白及其制备、纯化方法和应用技术

本发明专利技术提出了一种G72蛋白及其三种突变体蛋白，分别为G72‑6H、G72R30A‑6H、G72R30D‑6H、G72R30K‑6H，其特征在于，三种突变体蛋白G72R30A‑6H、G72R30D‑6H、G72R30K‑6H的基因为G72基因的Arg30分别突变成Ala、Asp及Lys。其制备和纯化方法包括以下步骤：步骤一、质粒制备；步骤二、蛋白质的表达；步骤三、蛋白的纯化。本发明专利技术利用分子生物学技术得到纯度较高的G72蛋白以及其三种突变体蛋白，可将其应用于精神分裂症病理的一系列研究中，有助于开发成治疗精神疾病以及诊断检测精神疾病的试剂，具备广阔的应用前景。

G72 protein and its three mutant proteins and their preparation, purification and Application

The invention provides a G72 protein and three mutant proteins, namely G72 6H, G72R30A 6H, G72R30D 6H and G72R30K 6H. The characteristics of the invention are that the Arg30 gene of G72 gene mutates into Ala, Asp and Lys respectively, of the three mutant proteins G72R30A 6H, G72R30D 6H and G72R30K 6H. The preparation and purification methods include the following steps: step 1, plasmid preparation; step 2, protein expression; step 3, protein purification. The invention obtains G72 protein with high purity and three mutant proteins by molecular biological technology, which can be applied to a series of pathological studies of schizophrenia, and is helpful to develop reagents for treating mental diseases and diagnosing and detecting mental diseases, and has broad application prospects.

【技术实现步骤摘要】
G72蛋白及其三种突变体蛋白及其制备、纯化方法和应用
本专利技术涉及现代分子生物
，具体涉及一种G72蛋白及其三种突变体蛋白及其制备、纯化方法和应用。
技术介绍
现今社会忙碌的生活步调与莫大的工作压力及家庭压力，造成患有精神疾病的病人日益攀升。部分精神疾病患者会有自杀的倾向，而其中又以精神分裂症所造成的后果最为严重，因此对于精神分裂症的治疗成为各方极欲解决的目标之一。精神分裂症是精神疾病中较为严重的精神障碍症状，受此影响的有约1％的世界人口和占近2.5％的医疗费用。目前至少有11个基因研究报告指出，精神分裂症与G72和DAO基因座相邻处具有高度关联性。G72与DAO也因此被当作精神分裂症、双相情感疾病及忧郁症的生物标志，用于找寻这些精神疾病与基因型间之关系。G72基因是一个灵长类动物特有的基因，G72蛋白(p：protein；L：largestformofG72)为G72基因的产物之一，由153个氨基酸所组成的胞浆蛋白。此基因座位于人类第13号染色体的长臂上，能与DAO产生交互作用，目前发现其为DAO的活化蛋白，可以增强DAO的催化功能，降低细胞内Dserine的浓度。Chumakov团队发现一个明显与精神分裂症相关的区域binA，在binA上有两个互补基因，称为G72与G30。此基因只存在于高等灵长类动物，并只表现于脑部及中枢神经系统中，会影响海马回的正常运作。由于D-serine为NMDA受器重要的配体之一，其浓度也被报导与精神分裂症相关。所以可能因为它们之间交互作用的影响，使得G72间接调控NMDA受体的活性进而诱发疾病产生。G72通常被认为是DAAO相互作用蛋白，也是N-甲基-D-天门冬氨酸受体激动剂，参与突触可塑性和兴奋毒性。NMDA受体的活化时需要有glutamate和D-serine做为共同增效剂结合于NR1上，才能有效的将NMDA通道打开，使得钠、钾、钙离子通过[8]。其中以钙离子最重要，因钙离子具有较高的通透性，与许多细胞功能调节有关，因此NMDA受体在许多生理及病理的发展过程扮演重要角色。当脑中的NMDA受体有损伤时，会使神经元细胞死亡，甚至会发生一些脑部方面的神经退化性疾病，如阿兹海默症、癫痫(epilepsy)、巴金森氏症等。目前精神分裂症仅能仰赖于临床症状诊断，在分子诊断方面，并无可靠的分子生物标记，只能确定它是一个高遗传的复杂性疾病。而最近的研究发现精神分裂患者白血球中G72(又称D-aminoacidoxidaseactivator,DAOA)的mRNA表达量可能较高(蓝先元教授未发表结果)。目前在基因库里没有G72同源基因的相关数据，但是有越来越多的证据针对G72和DAO潜在于重郁症和精神分裂症作用于D-serine神经传导的关联做研究。
技术实现思路
为了解决上述的技术问题，本专利技术提供一种G72蛋白及其三种突变体蛋白及其制备、纯化方法和应用。其目的在于，将得到G72蛋白及其三种突变体蛋白应用于精神分裂症病理的一系列研究中，有助于现代医学对于精神病症的深入研究，开发成治疗精神疾病以及诊断检测精神疾病的试剂，为攻克该系列疾病提供了方法。本专利技术提供G72蛋白及其三种突变体蛋白，分别为G72-6H、G72R30A-6H、G72R30D-6H、G72R30K-6H，其特征在于，三种突变体蛋白G72R30A-6H、G72R30D-6H、G72R30K-6H的基因为G72基因的Arg30分别突变成Ala、Asp及Lys。本专利技术进一步保护上述G72蛋白及其三种突变体蛋白的制备及纯化方法，包括以下步骤：步骤一、质粒制备：以cDNA为模板，加入引物进行PCR，进行30次循环后，以Pro-Taq将G72基因扩增后，将G72的PCR产物经过酶NdeI与XhoI处理后将其接入pET23a(+)质粒中，将G72的基因以EcoRI和XhoI处理后接入pGEX-6p-1质粒内，以定点突变的方法在引物上设计出单点突变，以制备出具体单点突变的pET23a-G72R30K-6H表达质粒，G72R30A-6H和G72R30D-6H的DNA片段是以两阶段聚合酶链反应完成；通过琼脂凝胶体电泳分析和DNA胶体片段纯化，得到纯化后的PCR产物，以限制酶NdeI及XhoI处理纯化过后的G72-6H片段与pET23a(+)载体，使得G72-6H有可与pET23a(+)互补的回文序列，以琼脂胶将载体和G72片段自胶体纯化，以限制酶BamHI及XhoI处理并纯化，加入连接酶及缓冲液于25℃下反应2小时，使G72接合入pET23a(+)载体中，接着转化入大肠杆菌Top10F’，于37℃培养至隔日，并以菌落PCR法确认连接成功之后将菌落挑起送测序公司测序，确认序列正确无误后即完成质粒制备，完成质粒制备后即大肠杆菌TOP10F’大量表达带有His-tag的G72-6H；步骤二、蛋白质的表达：将表达G72-6H的质粒转入大肠杆菌感受态细胞菌株，挑取单一颗菌落培养于LB培养液中，且于培养液中外加氨苄西林和氯霉素，于37℃隔夜培养后，从培养液中取出0.5ml加入5ml新鲜的LB于37℃培养，当菌体浓度达到OD600至0.4-0.6时，将温度维持于25℃，外加最终浓度为0.5mM的异丙基硫代半乳糖苷，隔夜培养后，取出1ml菌体于4℃下以离心，去除上清液之后加入适量的PBS，超声破碎仪将细胞壁打破，离心之后分离出可溶物与不可溶物；步骤三、蛋白质的纯化：G72蛋白N端接有GST标签，命名为GST-G72，以谷胱甘肽管柱纯化，将表达GST-G72蛋白的大肠杆菌均匀溶在PBS中，以超声破碎仪将其震破，以4℃，离心20分钟移除细胞碎片，将上清液过滤，以清洗缓冲液I清洗至数值稳定，再以清洗缓冲液II清洗数次至数值稳定，最后以冲洗缓冲液冲洗出GST-G72蛋白作为本专利技术进一步的改进，G72蛋白及三种突变体蛋白的引物为：pET23a-G72-6H:G72-F’–NdeI:ATATCATATGCTGGAAAAGCTGATGGGG72-R’-XhoI:TATACTCGAGTTCAGCTTTGGTAGAAGpET23a-G72R30A-6H:G72-R30A-F’:ATAGGTTTTCAAGCGAGCATTCTTCTGAGCG72-R30A-R’:GCTCAGAAGAATGCTCGCTTGAAAACCTATpET23a-G72R30D-6H:G72-R30D-F’:ATAGGTTTTCAAGACAGCATTCTTCTGAGCG72-R30D-R’:GCTCAGAAGAATGCTGTCTTGAAAACCTATpET23a-G72R30K-6H:G72-R30K-F’:GGTTTTCAAAAGAGCATTCTTCTGAG72-R30K-R’:TCAGAAGAATGCTCTTTTGAAAACC。作为本专利技术进一步的改进，过滤器的孔径为0.45μm。作为本专利技术进一步的改进，冲洗缓冲液由50mMTris-HCl、10mMpH为7.4的还原型谷胱甘肽制备而成。作为本专利技术进一步的改进，清洗缓冲液I为PBS缓冲液内含300mMNaCl，所述清洗缓冲液II为PBS缓冲液内含1MNaCl。作为本专利技术进一步的改进，离心转速为9000-12000rpm。作为本专利技术进一步的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.G72蛋白及其三种突变体蛋白，分别为G72‑6H、G72R30A‑6H、G72R30D‑6H、G72R30K‑6H，其特征在于，三种突变体蛋白G72R30A‑6H、G72R30D‑6H、G72R30K‑6H的基因为G72基因的Arg30分别突变成Ala、Asp及Lys。

【技术特征摘要】
1.G72蛋白及其三种突变体蛋白，分别为G72-6H、G72R30A-6H、G72R30D-6H、G72R30K-6H，其特征在于，三种突变体蛋白G72R30A-6H、G72R30D-6H、G72R30K-6H的基因为G72基因的Arg30分别突变成Ala、Asp及Lys。2.G72蛋白及其三种突变体蛋白的制备及纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一、质粒制备：以cDNA为模板，加入引物进行PCR，进行30次循环后，以Pro-Taq将G72基因扩增后，将G72的PCR产物经过酶NdeI与XhoI处理后将其接入pET23a(+)质粒中，将G72的基因以EcoRI和XhoI处理后接入pGEX-6p-1质粒内，以定点突变的方法在引物上设计出单点突变，以制备出具体单点突变的pET23a-G72R30K-6H表达质粒，G72R30A-6H和G72R30D-6H的DNA片段是以两阶段聚合酶链反应完成；通过琼脂凝胶体电泳分析和DNA胶体片段纯化，得到纯化后的PCR产物，以限制酶NdeI及XhoI处理纯化过后的G72-6H片段与pET23a(+)载体，使得G72-6H有可与pET23a(+)互补的回文序列，以琼脂胶将载体和G72片段自胶体纯化，以限制酶BamHI及XhoI处理并纯化，加入连接酶及缓冲液于25℃下反应2小时，使G72接合入pET23a(+)载体中，接着转化入大肠杆菌Top10F’，于37℃培养至隔日，并以菌落PCR法确认连接成功之后将菌落挑起送测序公司测序，确认序列正确无误后即完成质粒制备，完成质粒制备后即大肠杆菌TOP10F’大量表达带有His-tag的G72-6H；步骤二、蛋白质的表达：将表达G72-6H的质粒转入大肠杆菌感受态细胞菌株，挑取单一颗菌落培养于LB培养液中，且于培养液中外加氨苄西林和氯霉素，于37℃隔夜培养后，从培养液中取出0.5ml加入5ml新鲜的LB于37℃培养，当菌体浓度达到OD600至0.4-0.6时，将温度维持于25℃，外加最终浓度为0.5mM的异丙基硫代半乳糖苷，隔夜培养后，取出1ml菌体于4℃下以离心，去除上清液之后加入适量的PBS，超声破碎仪将细胞壁打破，离心之后分离出可溶物与不可溶物；步骤三、蛋白质的纯化：G72蛋白N端接有GST标签，命名为GST-G72，以谷胱甘肽管柱纯化，将表达GST-G72蛋白的大肠杆菌均匀溶在PBS中，以超声破碎仪将其震...

【专利技术属性】
技术研发人员：王茂峰，张颢腾，
申请(专利权)人：东阳市人民医院，
类型：发明
国别省市：浙江,33